KLF4通過Wnt信號通路抑制甲狀腺癌細胞EMT及侵襲遷移的實驗研究

陳 翔，劉利敏，張 琰，陳 勇，屈 悅，徐 宙，陸寶華

(上海市寶山區中西醫結合醫院甲狀腺外科 201999)

甲狀腺癌的發生、發展和轉移是一個復雜的過程，涉及許多因素。目前關于上皮間質轉化(EMT)在甲狀腺癌中的研究表明，EMT參與了甲狀腺癌的進展[1-2]。EMT過程涉及轉錄因子、生長因子、信號級聯、表觀遺傳調控和腫瘤微環境等組成的復雜網絡。據文獻報道，Kruppel樣因子4(KLF4)可以通過上調上皮基因表達和下調間質基因表達來調節EMT的進程[3-4]。而在惡性腫瘤中調控這些關鍵性分子的表達，能促進或抑制細胞的侵襲和轉移[5-6]。本課題組前期報道了KLF4在甲狀腺癌中的表達及對腫瘤侵襲轉移的影響[7]。本研究從Wnt/β-catenin信號通路角度探討KLF4調節甲狀腺癌細胞侵襲和遷移的分子機制，以闡釋對KLF4在甲狀腺癌侵襲遷移過程的認識。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞：甲狀腺乳頭狀癌細胞株KTC1購自武漢普羅賽爾公司(CL-0649)。主要試劑及器材：DMEM培養基購自杭州四季青公司；RNA提取試劑TRIzol購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司(15596-026)；逆轉錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司(R101-01/02)；PCR引物等由上海擎科生物公司合成；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自上海碧云天公司(P0010)；一抗β-catenin，基質金屬蛋白酶7(MMP7)和KLF4均為兔源性單抗購自美國Abcam公司；兔源性多抗上皮型鈣黏蛋白(E-cad)和神經型鈣黏蛋白(N-cad)分別購自美國Affinity公司和武漢三鷹生物公司；定量PCR儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司(Quant Studio 6)；分光光度計購自杭州奧盛儀器有限公司(Nano-100)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養、轉染及分組

體外細胞培養密度約為80%，對數生長期消化細胞，接種至培養板，每孔密度約5×105個，培養達80%融合度。慢病毒載體的組裝和測試等均由上海GenePharma公司承擔。KLF4-siRNA及陰性對照siRNA引物序列為見表1。相關轉染操作參閱LipofectamineTM2000說明。將KTC1細胞分成5組：(1)空白對照組，不作任何處理；(2)陰性對照組，轉染LipofectamineTM2000；(3)KLF4過表達組，轉染LipofectamineTM2000+KLF4；(4)siRNA-NC組，轉染LipofectamineTM2000+NC-siRNA；(5)KLF4-siRNA組，轉染LipofectamineTM2000+KLF4-siRNA。取5 μL脂質體融入培養液中混勻，在26 ℃下放置20 min。向每個孔中加入200 μL混合溶液，并轉移到37 ℃的培養箱中48 h，獲得的細胞RNA或蛋白質留待進一步檢測。

1.2.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測EMT過程中Wnt通路相關基因的表達水平

從對數生長期細胞中提取總RNA后將其逆轉錄為cDNA，并以cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系和反應條件見說明書。E-cad、N-cad、MMP7引物序列見表1，GAPDH為內參，繪制溶解曲線，以計算公式2-ΔΔCt算出EMT相關基因mRNA的表達水平。

表1 引物序列(5′-3′)

1.2.3Western blot檢測EMT過程中Wnt通路相關蛋白的表達

提取對數生長期細胞的總蛋白并檢測蛋白水平，變性后加樣，每孔40 μg，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，重復3次。轉膜后添加一抗，然后在冰箱中-4 ℃環境下過夜。24 h后加二抗稀釋，37 ℃孵育2 h，洗膜后增強化學發光法(ECL)顯像并保存圖像，BandScan計算圖像的灰度值。

1.2.4免疫熒光檢測細胞中KLF4和β-catenin的定位

制作細胞爬片并固定、穿孔，加入正常山羊血清并靜置20 min，添加一抗：兔抗KLF4(工作濃度為1∶50)，小鼠抗β-catenin(工作濃度5 μg/mL)，放入4 ℃濕盒中靜置24 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后加第二抗體，山羊抗兔IgG(Cy3標記)和山羊抗小鼠IgG[異硫氰酸熒光素(FITC)標記]，工作濃度均為1∶100。添加熒光染色劑后在避光條件下進行核染，最后在熒光顯微鏡下分析和收集圖像。

1.2.5蛋白質免疫共沉淀(Co-IP)檢測KLF4和β-catenin間的蛋白質相互作用

將KTC1細胞分為3組：KLF4處理組，予以2.0 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)處理24 h；input陽性對照組，加入等體積的裂解液處理；IgG陰性對照組，加入等體積的IgG處理。提取并定量細胞總蛋白500 μg，加入蛋白-A/G瓊脂糖珠，靜置1 h時。回收上清液，添加兔抗人β-catenin或KLF4單抗(工作濃度均為1∶200)，4 ℃孵育24 h。第2天，將蛋白-G瓊脂糖珠加入并混合4 h。用低強度放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液洗滌并收集瓊脂糖珠；加入裂解液和蛋白上樣溶液，在99 ℃加熱10 min；離心后保留上清液，除去瓊脂糖珠，余下步驟與常規Western blot相同。

1.2.6免疫組織化學(IHC)檢測甲狀腺癌組織及癌旁組織中KLF4蛋白表達

選取本院2019年7-12月甲狀腺癌標本45份，均為常規行單側腺葉+峽部切除或雙側全切+中央區淋巴結清掃。采用SP法檢測KLF4的表達水平，第一抗體購自武漢博士德生物有限公司，工作濃度為1∶150。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 KLF4和β-catenin在KTC1細胞質中的定位

免疫熒光檢測結果顯示，KLF4顯示綠色熒光，β-catenin顯示紅色熒光，圖像疊加后KLF4和β-catenin在部分KTC1細胞質中同時表達，KLF4和β-catenin有部分共定位，見圖1。

2.2 各組KTC1細胞EMT過程中Wnt信號通路中相關基因和蛋白表達水平比較

qRT-PCR結果顯示，KLF4過表達組E-cad mRNA表達明顯高于其他組(P<0.05)，N-cad 和MMP7 mRNA表達明顯低于其他組(P<0.05)；沉默干擾KLF4后，與其他組相比，KLF4-siRNA組中的E-cad mRNA明顯降低(P<0.05)，N-cad和MMP7 mRNA明顯升高(P<0.05)，見表2。Western blot結果顯示，KLF4過表達組中E-cad表達較其他組明顯升高(P<0.05)，而N-cad、MMP7表達則明顯低于其他組(P<0.05)，顯示KLF4過表達可以逆轉EMT；當沉默干擾KLF4時，上皮標志物減少，間質標志物增加，見表3、圖2。

表2 各組KTC1細胞Wnt通路相關基因表達水平比較

表3 各組KTC1細胞Wnt通路相關蛋白表達水平比較

圖1 各組細胞中KLF4和β-catenin蛋白表達

1:空白對照組;2:陰性對照組;3:KLF4過表達組;4:siRNA-NC組;5:KLF4-siRNA組。

2.3 各組KTC1細胞的遷移和侵襲能力比較

Transwell結果顯示，KLF4過表達組侵襲和遷移細胞數量最低，而KLF4-siRNA組中侵襲和遷移細胞數量最高(P<0.05)，見表4、圖3。

2.4 KLF4和β-catenin蛋白間的相互作用

Co-IP結果顯示，將KLF4抗體或β-catenin抗體進行正向或反向的Co-IP，均可以檢測出KLF4與β-catenin間的相互作用，見圖4。

2.5 KLF4在甲狀腺癌中的表達情況

KLF4在甲狀腺癌及癌旁組織中的陽性表達率分別為24.44%(11/45)和71.11%(32/45)，二者比較差異有統計學意義(χ2=19.639，P<0.001)。45份標本中，伴淋巴結轉移18份中KLF4表達4份陽性，而不伴淋巴結轉移27份中KLF4表達15份陽性，二者比較差異有統計學意義(22.22%vs.55.56%,χ2=4.919，P=0.027)。

表4 各組KTC1細胞遷移和侵襲細胞數比較

圖3 各組KTC1細胞遷移、侵襲情況

圖4 KTC1細胞中KLF4和β-catenin的相互作用

3 討 論

甲狀腺癌總體預后良好，若伴有腺外侵犯和淋巴轉移等重要獨立預后因素，預后明顯不佳[8-9]。EMT在腫瘤的侵襲、血行播散和微轉移形成等過程中扮演重要角色[10]。本課題組先前的研究[7]及本次臨床標本檢測均表明，KLF4在甲狀腺癌中低表達，并起著抑癌基因的作用。在本研究中，由于KLF4過表達處理癌細胞后，結果上皮標志物增加，間質標志物減少，并抑制了EMT過程；沉默KLF4表達后，結果卻相反，從而加速了EMT的過程。通過臨床標本檢測發現轉移淋巴結KLF4陽性率低，未轉移淋巴結陽性率高，可能提示KLF4表達缺失可能促進癌細胞淋巴結轉移。表明甲狀腺癌中KLF4水平的升高有望在逆轉EMT中發揮作用，KLF4可能通過參與甲狀腺癌的EMT過程而發揮重要作用。

有研究表明，多個信號通路與EMT相關[11-13]。據文獻報道，Wnt/β-catenin信號通路與甲狀腺癌細胞的EMT過程密切相關，并起重要作用[14]。KLF4作為一種廣泛存在于人體各種組織中的轉錄因子，可以參與多種細胞生物學行為的調節，并在腫瘤的抑制或發展中發揮作用[15-16]，這些差異可能取決于不同的條件和細胞類型。本研究通過Co-IP證實了KLF4下游的信號分子是β-catenin；免疫熒光顯示KLF4和β-catenin可以共表達。而且KLF4的過表達可降低β-catenin和N-cad蛋白的表達，增加E-cad的表達，并減弱腫瘤細胞的侵襲和遷移。表明細胞中過量的E-cad可以與游離的β-catenin結合形成結合物，這在一定程度上提高了細胞間的黏附性，而減輕了癌細胞的侵襲性[17]。體外實驗表明，癌細胞中β-catenin基因的缺失會削弱細胞的侵襲性[18]，推測原因是低水平的β-catenin不能與淋巴細胞增強因子/T細胞因子(TCF/LEF)轉錄因子有效結合。因此，本研究認為在KTC1細胞過表達KLF4之后，β-catenin表達降低，從而阻止β-catenin與TCF/LEF結合并有效地防止下游靶基因被激活。

與此同時，當KLF4在癌細胞中過表達后，MMP7低表達，這削弱了細胞遷移和侵襲的能力；而將KLF4干擾后，MMP7表達上調，腫瘤的侵襲和遷移能力得到增強。MMP7與惡性腫瘤的侵襲性生長和遠處轉移有關。VOKA等[19]發現，MMP7是轉移性大腸癌敏感性較好的生物標志物，外周血中MMP7的水平與肝轉移程度和生存預后密切相關。YUAN等[20]發現，人舌鱗狀細胞癌組織中MMP7的表達明顯高于非腫瘤組織，且與淋巴結轉移有關；細胞試驗表明MMP7能提高癌細胞的侵襲能力。本實驗中，KLF4過表達可以降低細胞內β-catenin和MMP7蛋白的表達，而KLF4干擾敲除后可促進β-catenin和MMP7的上調，表明KLF4可通過Wnt信號通路調節相關下游靶基因的表達，從而影響了腫瘤的侵襲和遷移能力。

綜上所述，本研究認為，在甲狀腺癌中，KLF4過表達可以抑制EMT過程，影響腫瘤的侵襲和遷移，并且該過程的實現取決于Wnt信號傳導通路的參與和調節。KLF4和甲狀腺癌間的關系表明，KLF4可能是有前途的預后標志物，也是甲狀腺癌的潛在治療靶標。