金屬硫酸鹽浸種對水稻種子萌發和秧苗鎘吸收的影響

董愛琴，李建國，楊 濤，陳院華，徐昌旭，萬 輝，彭志平，謝 杰，*

(1.江西省農業科學院 土壤肥料與資源環境研究所，農業農村部長江中下游作物生理生態與耕作重點實驗室，國家紅壤改良工程技術研究中心，江西 南昌330200；2.井岡山紅壤研究所，江西 吉安 343016；3.南昌市農產品質量安全檢測中心，江西 南昌 330009)

重金屬鎘(Cd)污染性強，污染范圍廣，生理毒性大，且易被水稻富集[1-3]。水稻通過根系吸收土壤中的Cd，繼而在體內轉運到葉片和穗軸中，隨后在籽粒灌漿期遷移到稻米中[4-5]，影響人類健康。近年來，稻米Cd污染問題在世界各地均有相關報道，已引起廣泛的社會關注[6-7]。

為應對Cd污染給水稻安全生產帶來的巨大威脅，學術界開展了大量的研究。針對水稻Cd富集規律的研究發現，Cd在水稻體內主要經過“根系吸收—木質部裝載轉運—維管組織定向運輸—韌皮部再轉運”等多個步驟轉移到稻米中[8]。根施或葉面噴施阻抗元素，利用其與Cd2+的拮抗作用，減少水稻根系對Cd的吸收或降低Cd在水稻體內的轉運效率，是一種可有效降低稻米Cd含量的措施[9-11]。例如：王世華等[12]發現，硅可通過阻塞細胞壁孔隙度和與Cd2+形成Si-Cd復合物的形式降低水稻對Cd的轉運效率；方勇等[13]發現，葉面噴施75、100 g·hm-2硒肥，可降低水稻籽粒Cd、Hg、Pb含量，并提高稻米的營養品質。還有研究表明，充足的鐵供應亦可以降低水稻根系和葉片中的Cd含量，改變Cd在水稻體內的分布特征[14-16]；葉面噴施ZnSO4也可有效降低水稻根、葉、穗軸的Cd轉運效率，降低糙米中的Cd含量[17]。此外，錳在降低糙米Cd含量、治理稻米Cd污染方面也表現出了較好的潛力[18-19]。

雖然研究人員就根部施用或葉面噴施微量元素降低水稻Cd含量的效果進行了大量的研究，但關于通過使用金屬鹽溶液浸種來降低稻米Cd含量的研究還未見報道。本文擬采取用含有鐵、鋅、錳等金屬元素的硫酸鹽溶液浸種的方式來降低水稻對Cd的吸收，期望從根本上改變根施或葉面噴施阻鎘劑成本高、耗費勞力等不足，形成一種輕簡化的Cd污染農田治理新技術。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻品種為五豐優286，采購自江西省南昌市種子市場，生產廠家為江西現代種業股份有限公司。該品種為秈型三系雜交水稻，是江西省廣泛種植的早稻品種。

1.2 試驗設計

1.2.1 出芽試驗

金屬硫酸鹽浸種：依照選用的金屬硫酸鹽(浸種劑)，分別設置FeSO4試驗組、ZnSO4試驗組和MnSO4試驗組。在每一試驗組內，均預先配置濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol·L-1的FeSO4、ZnSO4或MnSO4溶液作為相應的浸種液。按照浸種劑對應的金屬元素名稱及其濃度對各處理進行編號(例如，使用0.05 mol·L-1FeSO4溶液浸種的處理，其編號為Fe-0.05。其他依此類推)。各試驗組均使用清水浸種作為該組對照(CK)。每個處理設置3個重復。

選擇100粒飽滿的水稻種子，在SPX-150B-Z型恒溫培養箱(上海博迅醫療生物儀器股份有限公司)中，設定恒溫30 ℃和恒濕65%(相對濕度)的培養條件，依各處理設計避光浸種24 h，使水稻種子充分吸收浸種劑。之后，使用清水徹底清洗水稻種子，去除殘留的浸種劑，隨后將其轉移到預先鋪有兩層濾紙的培養皿中，注入清水，再次轉入恒溫培養箱中，在與上文設定相同的溫濕度條件下避光催芽，每日觀察并適時補充清水，使稻種1/2浸沒在水中。所有用于發芽試驗的容器均經沸水消毒30 min。

清水催芽5 d后，選取5粒根系最長的稻種，分別測量并記錄根長和芽長；催芽10 d后統計稻種發芽率。

1.2.2 水培試驗

另外選取100粒飽滿的水稻種子，在與出芽試驗相同的條件下進行浸種和催芽，每處理設置3個重復。待胚根長約1 cm時，轉移到裝滿霍格蘭(Hoagland)營養液(營養液中CdCl2濃度為8 μg·L-1)的水培盒中，放入RXZ型光照培養箱(寧波江南儀器廠)中進行培養。培養條件設置如下：每個循環光照16 h，黑暗8 h；溫度恒定為28 ℃，相對濕度恒定為50%。定期補充含有8 μg·L-1CdCl2的霍格蘭營養液，使根系充分浸泡在營養液中。待秧苗高度達到10 cm左右時取出，用自來水、蒸餾水充分漂凈，于75 ℃條件下烘干。使用ZM200型旋風式離心機(德國Retsch)粉碎整株秧苗并過0.5 mm篩，裝袋密封備用。

1.3 樣品檢測

參照GB 5009.15—2014《食品安全國家標準 食品中鎘的測定》，采用硝酸-高氯酸混合濕法消解，使用PinAAcle900T型原子吸收分光光度計(GFAAS，美國Perkin-Elmer)測定水稻秧苗樣品中的Cd含量。測試條件如下：樣品進樣量20 μL，稀釋液進樣量5 μL，(NH4)2HPO45 μL，干燥溫度110 ℃，灰化溫度500 ℃，原子化溫度1 600 ℃，清除溫度2 450 ℃。使用5300DV型電感耦合等離子發射光譜儀(ICP-OES，美國Perkin-Elmer)測定水稻秧苗中的Mg、K、P、B元素含量。測試條件如下：射頻功率1 500 W，載氣流量0.80 L·min-1，等離子體氣流量15 L·min-1，進樣量1.5 mL·min-1，軸向觀測。使用GBW10045(GSB-23)湖南大米成分分析標準物質作為質量控制標準樣品，經檢測，各元素的回收率為93.7%～104.2%，滿足檢測要求。用于樣品消解和測試的化學試劑均為優級純。

1.4 數據統計分析

使用Excel 2016、SPSS 24.0軟件對數據進行整理和統計分析，使用Origin 8.5繪制相關圖表。將各試驗組內的各濃度處理作為獨立因子進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，對有顯著(P<0.05)差異的，使用最小顯著差異法(LSD)進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同處理對水稻種子萌發的影響

浸種后將稻種轉移到培養箱中，30 ℃恒溫培養5 d后，測定胚根和胚芽的長度，同時計算根芽比(胚根長與胚芽長的比)。

在FeSO4試驗組中，所有處理的胚根長和胚芽長均顯著高于CK處理(圖1、表1)，且胚根長與FeSO4浸種液的濃度呈正相關。對于胚芽而言，除Fe-0.20處理的胚芽長顯著大于Fe-0.15處理外，其他浸種濃度下胚芽長并無顯著差異。

表1 不同處理下水稻的胚根長、胚芽長和根芽比

a，CK；b，c(FeSO4)=0.20 mol·L-1；c，c(FeSO4)=0.40 mol·L-1。

ZnSO4試驗組中，胚根的長度為0.21～0.51 cm，顯著低于CK處理的0.78 cm，表明ZnSO4處理抑制了水稻根系的生長，且胚根長與浸種劑濃度呈現負相關。從胚芽長看，除Zn-0.05和Zn-0.10處理顯著促進了胚芽生長外，其他處理與CK處理的胚芽長并無顯著差異。

MnSO4浸種會促進水稻種子胚根和胚芽的生長，但這種促生作用可能存在閾值。數據顯示，當MnSO4的濃度為0.10～0.35 mol·L-1時，各處理間胚根和胚芽的長度均沒有顯著差異，當MnSO4的濃度低于或高于這一范圍后，胚根長和胚芽長有所下降。

綜上，當浸種劑濃度在0.05～0.40 mol·L-1，FeSO4主要表現為促進水稻胚根和胚芽伸長的作用；ZnSO4抑制水稻胚根的生長，但濃度較低(0.05～0.10 mol·L-1)時可以促進水稻胚芽的生長；0.10～0.35 mol·L-1的MnSO4有一定的誘導水稻胚根和胚芽伸長的作用，但該濃度范圍內各處理的水稻胚根長和胚芽長無顯著差異。

隨FeSO4濃度增加，水稻根芽比呈現先降低后增加的趨勢，由CK處理的1.94逐漸降低到Fe-0.20處理的1.49，隨后逐漸升高至Fe-0.40處理的2.44。MnSO4試驗組也表現出類似的趨勢，其根芽比的最低值出現在Mn-0.35處理，隨后快速回升到Mn-0.40處理的1.87。ZnSO4浸種后，由于胚根的生長受到了明顯的抑制而胚芽的長度變化并不明顯，因此根芽比隨ZnSO4增加呈現逐漸下降的趨勢。

避光催芽10 d后，FeSO4試驗組水稻種子的出芽率為52.3%～72.0%(圖2)，均顯著高于CK處理42.0%的出芽率水平，說明FeSO4浸種能夠不同限度地提高水稻種子的出芽率，但當FeSO4的濃度達到0.15 mol·L-1后，繼續提高FeSO4的濃度并不能進一步提高水稻種子的出芽率。與FeSO4試驗組類似，ZnSO4浸種也可顯著提高水稻種子的出芽率，但各ZnSO4濃度下水稻種子的出芽率并無顯著差異。對于MnSO4試驗組，各處理下水稻的出芽率整體表現為隨著MnSO4濃度增加先增加后降低的趨勢，除Mn-0.05和Mn-0.40處理水稻的出芽率與CK差異不顯著外，其他處理的出芽率均顯著高于CK處理。

圖2 不同處理下水稻種子的出芽率

以上結果說明，本試驗選用的3種金屬硫酸鹽浸種均能提高水稻的出芽率。在僅考慮出芽率的前提下，即使當浸種劑的濃度達到0.40 mol·L-1時，FeSO4和ZnSO4浸種仍能顯著促進水稻種子的萌發；但在此濃度下，MnSO4浸種對水稻出芽的促進作用已經消失。

2.2 不同處理對水稻秧苗鎘含量的影響

使用FeSO4浸種后，除Fe-0.05處理的秧苗Cd含量較CK顯著增加、Fe-0.10處理與CK處理的Cd含量無顯著差異外，其他處理的Cd含量(1.23～1.66 mg·kg-1)均顯著低于CK處理(3.12 mg·kg-1)，降幅為46.79%～60.58%(圖3)。使用ZnSO4浸種后，各處理的Cd含量為6.06～7.05 mg·kg-1，顯著高于CK處理，增幅在83.96%～114.18%，說明ZnSO4浸種可能促進了水稻秧苗對Cd的吸收轉運。使用MnSO4浸種后，各處理水稻秧苗的Cd含量均顯著低于CK，降幅為14.22%～34.68%，且除Mn-0.05處理外，其他MnSO4浸種處理的水稻秧苗Cd含量沒有顯著差異，說明MnSO4浸種具有降鎘的效果。

圖3 不同處理下秧苗的Cd含量

2.3 不同處理對水稻秧苗營養元素含量的影響

相較于CK處理，除Fe-0.20處理的Mg含量和Fe-0.40處理的K含量外，FeSO4浸種對秧苗Mg、P、K含量并無顯著影響，但可以顯著增加秧苗中的B含量，且以Fe-0.40處理的B含量最高，增幅為59.56%(表2)。這說明，FeSO4浸種并不會抑制水稻秧苗對營養元素的吸收，且對B的吸收有一定的促進作用。

表2 不同處理下水稻秧苗的Mg、B、P、K含量

ZnSO4浸種顯著降低了除Zn-0.05、Zn-0.35和Zn-0.40外其他處理水稻秧苗的Mg、B含量，但同時顯現出促進水稻秧苗P吸收的趨勢，如Zn-0.40和Zn-0.35處理的P含量就顯著高于CK，增幅分別為15.81%和11.42%。此外，ZnSO4浸種處理對水稻秧苗K含量無顯著影響。

經MnSO4浸種后，隨MnSO4濃度增加，水稻秧苗的Mg含量呈現先增加后降低的趨勢，當MnSO4濃度為0.30 mol·L-1時取得最大值(3.52 g·kg-1)，隨后逐步下降到Mn-0.40處理的3.05 g·kg-1。MnSO4浸種能夠顯著促進水稻對P的吸收，且秧苗的P含量與MnSO4浸種液濃度呈正相關。MnSO4浸種對水稻秧苗的B、K含量無顯著影響。

3 討論

浸種是影響水稻種子萌發和秧苗生長的重要措施之一[20]。本研究發現，金屬硫酸鹽浸種在促進水稻種子萌發、降低水稻秧苗對Cd的吸收方面具有積極的作用。

3.1 金屬硫酸鹽浸種促進水稻種子萌發

一般認為，過高的鹽分會導致植物吸水困難、生理代謝發生紊亂，從而抑制水稻的發芽和生長[21]。作者團隊在2020年的田間試驗中發現，金屬鹽浸種可有效降低糙米Cd含量，隨即圍繞水稻種子對浸種液的最大耐受濃度開展室內試驗。但由于本試驗采用的是當年田間試驗過程中剩余的水稻種子樣品，導致CK的出芽率偏低(約50%)。但從試驗效果看，金屬硫酸鹽浸種處理確實促進了水稻種子的萌發。

本研究發現：當浸種所用的FeSO4的濃度達到0.40 mol·L-1時，仍能顯著提高五豐優286品種的發芽率，并顯著促進水稻胚根和胚芽的生長；當浸種所用的MnSO4的濃度為0.10～0.35 mol·L-1時，也有類似的效果；但ZnSO4浸種會抑制水稻胚根的生長。上述試驗條件下，浸種劑中Fe2+、Mn2+的質量濃度分別達到2.24×104、1.93×104mg·L-1，這與其他文獻報道的高金屬鹽條件會抑制水稻生長的報道存在較大差異[22]。

Fe、Mn、Zn在水稻生理過程中的作用，及水稻對各元素的耐受能力存在較大差異，這就使得本試驗中FeSO4、ZnSO4、MnSO4三種浸種劑對水稻種子萌發表現出不同的作用。適量的鐵、鋅、錳等元素具有促進水稻葉綠素合成、參與植物光合作用的功能[23]，其中，鐵、鋅作為呼吸過程中關鍵酶的活性中心，直接參與酶的合成[24-25]，錳在作物體內作為酶的催化劑參與酶催化系統[26]，在磷酸化反應、脫羧基反應等多種酶促反應中發揮作用[27]。但當這些金屬元素過量時，也會對水稻的生理活動產生明顯的毒害作用。陳雅玲等[22]在水稻的催芽過程中持續添加高達200 mg·L-1的水鐵礦、螯合鐵和硫酸亞鐵溶液，發現并沒有對水稻種子的發芽率產生影響，且100 mg·L-1的硫酸亞鐵溶液還能促進水稻根系的生長。董麗平等[28]研究發現，對岡優737而言，當MnCl2濃度低于24 mmol·L-1時，并不會對其發芽率、發芽勢等指標產生顯著影響。王曉波等[29]研究發現，Zn2+濃度小于3 mg·L-1時，水稻發芽率與Zn2+濃度呈現正相關，但高于這一質量濃度即會出現明顯的抑制作用。諸多研究顯示，水稻對Zn2+的耐受性較低，多集中在10-2mmol·L-1以下[30-31]，遠低于本試驗所使用的ZnSO4浸種液的最低濃度。另外，不同水稻品種對金屬離子的耐受能力也存在差異[32]。本試驗表明，五豐優286對Fe、Mn的耐受能力相對較高，但對Zn的耐受能力較差。

為進一步驗證金屬鹽浸種對水稻出芽率的影響，2021年春季，我們采用新購入的五豐優286稻種進行浸種出芽試驗，結果與本文所述結果類似，其中，CK處理的出芽率在80%左右，不超過0.35 mol·L-1的FeSO4、ZnSO4和MnSO4浸種處理相較于CK可以顯著提高水稻種子的出芽率，但ZnSO4浸種抑制水稻胚根伸長的現象依然存在(相關試驗結果另文發表)。

我們認為，高濃度FeSO4和MnSO4浸種之所以能夠促進水稻種子萌發，主要是由于浸種時間較短(24 h)，且浸種后經充分清洗并采用清水催芽，也就是說，水稻種子并未長期處于高鹽環境中，因而并不致對水稻種子的生理活性產生明顯干擾。當從高鹽浸種環境恢復到清水催芽條件時，水稻出于本能的作用，刺激根系生長以滿足萌發過程中的水分需求，這在客觀上就表現為FeSO4和MnSO4促進了水稻根系的萌發。FeSO4和MnSO4浸種后，水稻的根芽比均隨浸種劑濃度增加呈現先降低后增加的趨勢。這說明，在低濃度區，金屬硫酸鹽浸種對水稻胚芽生長的刺激作用要強于胚根；而在高濃度區，金屬硫酸鹽浸種對胚根生長的刺激作用明顯強于胚芽。

3.2 金屬硫酸鹽浸種降低水稻植株Cd含量

Cd并非作物生長的必需元素。研究表明，Cd主要通過占用作物必需元素(如Fe2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+)的離子通道，與必需元素競爭細胞膜轉運蛋白等途徑，以離子形態或金屬螯合物的形態進入根系細胞[33]。借助于分子生物學技術，研究人員已經鑒定出水稻體內一系列與Cd2+吸收轉運有關的蛋白[34]，主要包括影響Mn2+、Fe2+、Zn2+轉運的天然抗性相關巨噬細胞蛋白(NRAMP)[35-36]、影響Zn2+、Cu2+轉運的重金屬ATP酶(HMA)[37-38]和影響Zn2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+轉運的鋅鐵轉運蛋白(ZIP)[39-40]。

研究顯示，通過基施或葉面噴施含鐵、錳、鋅的肥料能夠降低糙米中的Cd含量[17-19，41-43]。適量的金屬離子可以與Cd2+競爭根系細胞膜上的吸附位點[44]，或與水稻體內OsHMA2[45]、OsNramp[46]等轉運蛋白的重金屬位點結合，抑制Cd從木質部向韌皮部的轉運，從而增強作物對重金屬的抗性。從本文試驗結果看，FeSO4試驗組除Fe-0.05和Fe-0.10處理外，其余處理均顯著降低了水稻秧苗的Cd含量。這可能是因為，高濃度的Fe2+快速進入水稻種子后，部分轉運蛋白被Fe2+飽和，這就使得Cd2+無法通過相應的離子通道進入根系細胞，從而起到抑制水稻Cd吸收的作用。但當浸種液中FeSO4的濃度超過0.15 mol·L-1時，進一步提高浸種劑濃度，并不能顯著提升FeSO4浸種的降Cd效果。與FeSO4處理類似，當浸種液的MnSO4濃度超過0.10 mol·L-1時，也出現了秧苗中Cd含量的平臺期。我們推測，使用高濃度的金屬鹽浸種，金屬離子能夠在水稻種子萌發的初期先行競爭與Cd2+轉運有關的蛋白或離子通道，從而抑制水稻秧苗對Cd2+的吸收，然而當轉運蛋白被充分飽和后，進一步提高金屬鹽濃度并不能顯著降低水稻秧苗對Cd2+的吸收。本試驗表明，雖然提高浸種液中FeSO4和MnSO4的濃度對提高出芽率有積極作用，但更高的浸種劑濃度并不能進一步提高對秧苗的降Cd效果。從成本和收益的角度考慮，把FeSO4和MnSO4的濃度控制在0.20 mol·L-1是一個比較理想的選擇。

供試品種對Zn的耐受性較低，因此在ZnSO4浸種后受到明顯的鋅毒害，生理機能被打亂。這就導致ZnSO4浸種下不僅水稻胚根的生長受到抑制，而且水稻秧苗的Cd含量亦顯著增高。這說明，高濃度的ZnSO4并非理想的降Cd浸種材料。

諸多研究顯示，Cd在水稻不同部位的含量差異很大，呈現根系>穗軸>葉片>籽粒的特點[6]，這主要是由于籽粒中的Cd主要來源于地上部的轉運[46]。通過控制Cd在根系和秸稈中的含量，將有助于抑制Cd從水稻營養器官向籽粒的轉移，從而降低稻米的Cd含量。本試驗數據顯示，使用硫酸亞鐵和硫酸錳浸種能夠降低水稻秧苗的Cd含量，這對于降低水稻籽粒中的Cd含量具有較大的幫助。

3.3 金屬硫酸鹽浸種與水稻營養元素的轉運

陽離子通道膜轉運蛋白是一種非選擇性的蛋白質，同時也是Mg2+、K+等營養元素進入細胞的重要途徑[47]。本研究顯示，金屬鹽浸種并不影響水稻幼苗對Mg2+和K+的吸收。相較于K+(1.33 ?)，Mg2+的離子半徑為0.65 ?，與Fe2+、Zn2+和Mn2+的離子半徑(分別為0.76 ?，0.74 ?和0.80 ?)比較接近[48]，因此Mg2+與浸種液中的金屬離子在競爭通道上處于類似的水平。本試驗結果顯示，金屬鹽浸種并未對水稻秧苗中的Mg含量產生趨勢性的影響，暗示Mg2+在水稻體內可能存在多種吸收和轉運途徑[49]。

FeSO4浸種促進了水稻秧苗對B的吸收。研究發現，當外界環境中B含量充足時，B主要通過質膜的被動擴散進入植物體內，即幼苗生長作用越旺盛，B的含量越高[50]；而在缺B環境下，則主要通過特異性跨膜蛋白的主動運輸來滿足植物對B的需求[51]。在本試驗條件下，營養液中硼酸含量充足(4.5 mg·L-1)，且主要以(〗BO3-3的形式存在，因此可以認為水稻秧苗對硼的吸收主要是通過被動擴散來進行的[52]。本試驗中，FeSO4浸種促進了水稻秧苗的生長發育，這在客觀上增加了水稻對B的吸收。

綜上，本研究發現，特定金屬鹽浸種可以在刺激水稻種子萌發的基礎上減少秧苗對重金屬Cd的吸收，而且不會對營養元素的吸收產生顯著的負面影響。雖然本試驗僅圍繞水稻種子萌發和秧苗開展研究，但試驗結果仍展現出可通過飽和根表特定轉運蛋白來降低水稻對Cd吸收的潛質，在實際大田生產中有應用潛力，可為鎘污染稻田的輕簡化安全利用提供新的思路。