菜用大豆籽粒中蔗糖的遺傳與調控機制研究進展

張偉梅，張古文，馮志娟，劉 娜，王 斌，卜遠鵬，*

(1.浙江省麗水市農林科學研究院，浙江 麗水 323000；2.浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

菜用大豆，也常被稱為“鮮食大豆”或“毛豆”，屬于豆科，大豆屬，栽培大豆種[Glycinemax(L.)Merri.]，是在粒寬達到莢寬的80%～90%，籽粒飽滿，豆莢和籽粒顏色翠綠時采收的大豆[1-2]。菜用大豆自宋代起即在中國發展[1]，目前其生產和貿易在我國國民經濟中占有重要地位。我國菜用大豆年種植面積約40萬hm2，總產量超過400萬t，年產值約100億元，是世界上最大的菜用大豆生產國和出口國，出口量約占世界總量的52%[3]，雖然美國引領著世界大豆的生產和出口，但是其對菜用大豆消費量的約40%依靠從中國進口[4]。

菜用大豆的品質對其市場接受度和價格起著決定性作用。菜用大豆的品質主要體現在食味品質、營養品質、外觀品質等方面，其中食味品質主要包括入口后能夠明顯感知的甜味、香味、鮮味和質地[5]，是菜用大豆作為休閑食品消費時最重要的性狀[6]。優良的食味品質不僅可以在感官上給消費者帶來愉悅的體驗，而且也直接影響人體對菜用大豆的消化和吸收，是目前菜用大豆品質研究的重點[7]。甜味是菜用大豆區別于普通粒用型大豆的顯著特征之一，消費者尤其青年消費者喜歡較甜的菜用大豆[8-9]。通常認為菜用大豆的甜味主要歸因于可溶性糖含量[10]，可溶性糖主要包括蔗糖、葡萄糖、果糖以及棉子糖家族寡糖(棉子糖、水蘇糖)等[11]，其中蔗糖含量為21.1～102.0 mg·g-1，約占可溶性總糖的71%[12]，是麥芽糖的2.34倍，果糖的14.8倍，葡萄糖的19.1倍[13]，與甜度極顯著正相關(r=0.977，P<0.01)，是決定菜用大豆甜度的關鍵因素[9]；同時蔗糖含量是影響菜用大豆食味品質的最主要因素[14]，與感官評分極顯著正相關(r=0.864，P<0.01)[11]。因此，提升蔗糖含量是菜用大豆栽培和品種選育研究的焦點[15]。

菜用大豆蔗糖含量與栽培管理、貯藏條件、發育時期以及品種特性等相關[12，16-18]。苗期施鉀肥能夠顯著提高菜用大豆籽粒蔗糖濃度，葉面增施鉀肥可進一步提高蔗糖濃度[19-20]；此外烯效唑和氨基乙酸二乙酯(DA-6)等植物生長調節劑也可促進蔗糖在菜用大豆籽粒中的積累[21]。貯藏條件對菜用大豆的蔗糖含量影響很大，當菜用大豆采收后在25 ℃下保存1 d后，蔗糖含量降幅達60%以上；若采收后立即分別保存于-20 ℃和-4 ℃環境中，11 d后蔗糖含量僅比剛采收時分別下降9.2%～13.5%和20.2%～24.1%[22]。大豆籽粒中蔗糖一般是隨著種子的成熟呈現先增后降的趨勢，在R6期(鼓粒期)達到最大值，之后逐漸下降，R8期(成熟期)約降至R6期的77.9%[23-24]。菜用大豆籽粒蔗糖含量在不同品種中差異巨大，侯金鋒[25]對來源我國不同地區的323份大豆種質資源鮮食期籽粒蔗糖含量進行測定，結果表明，其變化范圍是11.4～47.5 mg·g-1，品種特性是影響菜用大豆蔗糖含量的決定性因素，品種改良是提高菜用大豆蔗糖含量的根本的方法。解析和歸納蔗糖在菜用大豆籽粒中的遺傳與調控機制，對于加速菜用大豆食味品質的遺傳改良，提升我國菜用大豆的國際市場競爭力具有重要意義。本文主要對菜用大豆籽粒中蔗糖積累的遺傳基礎、蔗糖代謝過程中關鍵酶及同源基因的克隆與調控機制研究進行了歸納總結，并展望了今后菜用大豆蔗糖含量遺傳改良發展趨勢，以期為菜用大豆食味品質的提升提供參考依據。

1 大豆籽粒中蔗糖含量的遺傳機制研究

蔗糖含量對菜用大豆以及豆腐、豆漿、納豆等多種食用大豆的品質具有重要影響[26]，為改良大豆品質，育種家們做了大量工作探究蔗糖含量的遺傳基礎。研究表明，大豆蔗糖含量具有較高的遺傳率(H2=0.74～0.79)[27-29]，在雜交后代中普遍存在超親現象，因此大豆中蔗糖含量受加性基因控制，對雜交后代進行連續選擇可以獲得較大的遺傳增益[29-31]。Mebrahtu等[32]利用10份菜用大豆種質通過完全雙列雜交方法對蔗糖積累的遺傳規律進行了研究，結果表明，大多數表現出顯著負特殊配合力效應的雜交組合往往親本之一或雙方具有較低的一般配合力效應，因此，菜用大豆蔗糖含量主要受加性或加性×顯性基因控制；由于非加性方差顯著，育種過程中可采用“單粒傳法”等使雜交后代迅速純合，同時為后代保留較大的選擇壓力，至F5或F6時在多環境下對優良株系進行選擇鑒定。

由于蔗糖含量的測定工作費時費力，為通過分子標記輔助選擇加速食用大豆品種改良進程，目前已經挖掘到一批與大豆籽粒蔗糖含量緊密連鎖的位點/分子標記(表1)。2000年Maughan等[33]使用包含164個RFLP、6個SSR和3個RAPD的分子標記首次對蔗糖含量進行了QTL分析，在7個連鎖群上共鑒定到17個與大豆蔗糖含量緊密連鎖的分子標記。隨后又有許多研究人員相繼進行了蔗糖含量相關的QTL定位研究[27-29，34]。Kim等[27]利用Keunolkong×Iksan10衍生的F2:10重組自交系(RIL)群體，基于99個SSR標記和2個形態學標記，通過單因素方差分析和多元回歸的方法檢測到3個與蔗糖含量連鎖的QTL，其中位于L連鎖群上Satt278-Satt523區間內存在一個主效QTL，可解釋21.39%的表型變異；隨后該研究者使用Keunolkong×Shinpaldalkong衍生的RIL群體，基于108個SSR標記和2個形態學標記檢測到2個QTL[29]。但上述研究由于可用的標記數目少，導致QTL定位結果的分辨率不足，限制了研究結果在實際生產中的應用。近年來高通量基因分型技術快速發展，為蔗糖含量相關QTL的精細定位提供了便利。Lee等[34]使用Axiom?180K SoyaSNP芯片對Kim等[27]報道的RIL群體進行基因分型，使用其中8 967個高質量分子標記構建高密度連鎖圖譜，通過完備區間作圖法對蔗糖含量進行精細定位，鑒定到3個QTL，其中qtl_SUC3位于19號染色體，LOD=11.73，可解釋36.87%的表型變異；前人在19號染色體上將蔗糖含量的QTL定位在33 000～36 700 kb[27，29，33]，而qtl_SUC3將定位區間進一步縮小至34 327～34 692 kb，區間內包含18個候選基因。Zeng等[28]使用MFS-553×PI 243 545衍生的不同世代的家系群體，分別使用兩套分子標記在3個不同環境下檢測到3個蔗糖含量相關的新的QTL。除了以上通過基于家系群體的連鎖作圖方法定位蔗糖相關QTL之外，Vaughn等[35]分別使用2個不同的自然群體，通過關聯分析鑒定到3個與蔗糖含量顯著關聯的SNP。目前相關研究的對象多是成熟大豆籽粒，對于鮮食期菜用大豆籽粒蔗糖含量的QTL定位研究鮮見報道。Hou等[36]使用323份來自全中國不同地區栽培大豆，使用101個SSR標記對鮮食期大豆籽粒中的蔗糖含量進行了關聯分析，共鑒定到9個蔗糖相關的標記分布于9個不同的連鎖群上，但其中不存在不同環境下可以穩定檢測到的標記，表明菜用大豆蔗糖含量可能是由多個易受環境影響的微效基因共同控制的。由于效應值較低，在性狀改良過程中，進行分子輔助選擇或特異片段的導入等應用時，單個位點的作用可能效果有限，需要多個位點的協同選擇或共同導入。同時，許多主效QTL在不同的研究中不能被重復檢測到，原因可能是控制蔗糖含量的大效應等位基因較少或基因×環境的互作效應較強[28，35]，因此在更廣泛的遺傳群體中發掘含有更強遺傳效應的等位基因資源尤為重要[37]。

表1 目前已定位的與大豆籽粒蔗糖含量相關的位點/分子標記

菜用大豆中總可溶性糖含量約為59.7 mg·g-1，其中蔗糖含量最高，為43.1 mg·g-1，其次是棉子糖和水蘇糖，分別為2.1 mg·g-1和1.1 mg·g-1，葡萄糖和果糖含量更低，二者之和約1.7 mg·g-1[11]。蔗糖、葡萄糖和果糖有利于提升豆制品的風味，而棉籽糖和水蘇糖等寡聚糖雖然可以促進雙歧桿菌生長，具有維持腸道正常功能的生理活性[38]，但是同時這類糖屬于抗營養因子，不能被體內的酶分解而會引起非反芻動物的腸胃脹氣和腹瀉[39]，此外還能產生不良風味[37，40]。在大豆籽粒發育過程中，低聚糖家族的合成要以消耗蔗糖和肌醇半乳糖苷為代價，因此育種家可以通過降低大豆籽粒中低聚糖含量而增加蔗糖含量，實現大豆食味和營養品質的改良[41]。Skoneczka等[37]使用一個蔗糖含量升高、水蘇糖降低的突變體材料PI200508作為親本之一構建了2個F2群體，將QTL定位在C2連鎖群上標記1157BAT21和157MAT36之間的724 kb的范圍內，該區間共包含66個預測基因，將其中1個半乳糖基轉移基因的同源基因作為候選基因，通過序列比對發現該基因上存在一個3 bp的缺失導致棉籽糖合酶功能突變，將該位點開發成標記Rsm1，與Rsm1共分離的QTL分別可解釋60%和76%的蔗糖含量表型變異。隨后研究者又發現棉籽糖合成酶2(RS2，Glyma.06g179200)和3(RS3，Glyma.05g003900)基因的突變基因同時存在時可以獲得超低低聚糖表型[42]。RS2中存在的一個3 bp堿基缺失突變，導致第331位氨基酸從高度保守的色氨酸變為起始密碼子[43]，或由于一個錯義突變使第107位的蘇氨酸變為異亮氨酸[44]，二者都可降低大豆籽粒中低聚糖含量而對其他農藝性狀不造成不良影響。最新的一項研究表明，當存在RS2突變等位基因時，可直接對RS3等位基因的新變體(rs3snp5，rs3snp6)和錯義等位基因(rs3G75E)進行分子標記輔助選擇，可快速獲得超低低聚糖株系[41]。

2 蔗糖的合成與代謝調控機制研究

目前植物中蔗糖的合成、轉運與分解途徑已較為明確[45]，概括地講，CO2在葉綠體中通過開爾文循環固定并轉化為磷酸丙糖(Triose-P)；一部分Triose-P轉化為ADP-葡萄糖(ADP-glucose，ADP-Glc)，進而合成淀粉，淀粉在夜間又分解為葡萄糖(glucose，Glc)或麥芽糖(Maltose，Mal)后轉運至細胞質；還有一部分Triose-P直接轉運至細胞質中為呼吸作用等其他新陳代謝過程提供原料。Glc在己糖激酶作用下發生磷酸化產生葡萄糖-6-磷酸(Glc-6-phosphate，Glc-6-P)，在Glc-6-P異構酶的催化下轉化為果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate，Fru-6-P)，一部分Fru-6-P進一步轉化為UDP-葡萄糖(UDP-Glc)，蔗糖磷酸合酶(Suc-phosphate synthase，SPS)以Fru-6-P和UDP-Glc為底物合成磷酸蔗糖(Suc-phosphate，Suc-P)，進而在磷酸蔗糖磷酸酶(Suc-phosphate phosphatase，SPP)作用下轉化為蔗糖(sucrose，Suc)。由此，Suc作為植物光合作用碳同化的最初能量和碳源供體，通過韌皮部篩管分子/伴細胞復合體或胞間連絲裝載入韌皮部，隨著蔗糖的積累增多水分滲透進來產出高膨壓，驅動同化產物向其他器官尤其合成代謝活躍的果實或種子、塊莖等庫器官運輸[46]。

蔗糖磷酸合酶(SPS)的主要功能是調節蔗糖和淀粉的分配，參與細胞的分化及纖維細胞壁的合成，影響植物的生長發育，影響植物種子、果實的品質，參與植物的耐逆響應等[25]，是植物細胞質中蔗糖合成的主要限速酶[47]，是影響大豆葉片中蔗糖合成的關鍵酶[48]。在菜用大豆籽粒發育過程中，SPS的活性逐漸升高，在花后24～36 d升高幅度顯著加快，之后又趨于緩慢；高蔗糖含量的菜用大豆品種SPS的活性高于低蔗糖含量的品種[49]。SPS活性與菜用大豆子葉和胚軸的蔗糖含量顯著正相關，SPS活性的峰值與菜用大豆籽粒各部位蔗糖含量的峰值重合，處于菜用大豆鮮莢的采摘期，較高的SPS活性有利于菜用大豆食用品質的提高[15]。SPS家族具有滲透脅迫位點[50]、14-3-3蛋白結合位點[51]和光調控位點[52]三個保守的磷酸化位點，這些位點的磷酸化和去磷酸化可調節SPS的活性。對SPS蛋白結構進一步分析發現，在SPS上除了含有與轉移葡糖基功能相關的N端葡糖基轉移區外，還含有C端磷酸蔗糖磷酸酶(SPP)類似區及中間的連接區，使SPS與SPP結合形成復合體催化蔗糖的合成反應[53]。徐志華[54]在菜用大豆中對擬南芥AtSPP1進行同源克隆獲得了GmSPP1，表達模式分析表明GmSPP1的表達量變化與GmSPS1表達量變化一致，其表達量隨著籽粒發育逐漸升高；在擬南芥中過表達GmSPP1可使轉基因株系種子中的蔗糖含量顯著升高。

運輸到庫端的蔗糖卸載后再進行水解得到己糖產物，己糖不僅作為植物異養的底物，還作為一種信號分子調節細胞的生長和發育[55-56]。植物中具備蔗糖分解功能的酶有兩類，分別為蔗糖合酶(sucrose synthase，SS，也簡稱SuSy/SUS等，EC2.4.1.13)和轉化酶(invertase，INV，EC3.2.1.26)。SUS和INV在庫端將蔗糖分解，形成從源到庫的蔗糖濃度梯度，為蔗糖由韌皮部向果實的運輸提供壓力，保證蔗糖向庫中的持續供應[57]。質外體途徑的蔗糖要通過細胞壁轉化酶(cell wall invertase，CWIN)水解為葡萄糖(Glc)和果糖(Fru)之后才能轉運至細胞質，此外Glc還可能通過G蛋白信號調節蛋白(regulator of G-protein signaling，RGS)作為一種信號分子調節基因的表達；通過胞間連絲或蔗糖轉運蛋白直接進入細胞質的蔗糖被細胞質轉化酶(cytoplasmic invertase，CIN)和SUS水解，產生的己糖用于合成淀粉、纖維素和果聚糖等多聚糖，或參與糖酵解過程和磷酸戊糖途徑為脂肪、蛋白質等的合成提供原料。此外，己糖的水平還可以被核定位己糖激酶(hexokinase，HXK)或其他蛋白質感知進而對基因的表達產生影響，己糖和蔗糖也可直接調節含有糖應答元件的基因的轉錄(包括編碼轉錄因子)。

蔗糖合酶(SUS)是一種存在于細胞質中的可逆的酶，既可催化蔗糖合成又可催化分解。在菜用大豆花后9～30 d，SUS活性以分解方向為主，但隨著發育的進行，其分解活性逐漸下降，合成活性逐漸升高；花后30～36 d合成活性均驟然升高；36～42 d，SUS合成活性和分解活性保持相對穩定[49]。SUS催化的蔗糖合成和分解過程可為植物中的淀粉、胼胝質和纖維素等多糖物質的生物合成提供底物，故在植物碳源分配中起關鍵調控作用，進而對相關重要農藝性狀和非生物脅迫響應發揮重要作用[57]。鑒定和克隆植物的SUS基因是了解其生理功能和代謝機制的第一步，利用比較基因組學進行基因家族分析是基因功能研究的前提。目前已從玉米、水稻和陸地棉等多種作物中對SUS基因家族進行了全基因組鑒定，并發現該家族在作物生長和產量形成中發揮著重要的作用[58]。晁毛妮等[59]在大豆基因組共鑒定到12個SUS基因家族成員，其中GmSUS8在種子中表達量最高，其他組織表達量很低。SUS基因對種子發育調控作用在擬南芥[60]、普通菜豆[61]和棉花[62]等許多植物中已經被證明，因此推測GmSUS8在大豆種子發育過程中起著重要作用。GmSUS1、GmSUS5和GmSUS7在大豆根瘤中特異性高表達，蔗糖代謝為豆科植物的根瘤提供碳骨架能量[63]，且固氮作用相關的蛋白也依賴于SUS的活性[64]，表明它們可能在大豆固氮過程中起著重要作用。生長發育過程中的低溫、干旱和鹽脅迫等均會對大豆產量造成嚴重影響，SUS家族基因如擬南芥AtSUS1[60]，大麥HvSUS1和HvSUS3[65]等在植物應對逆境脅迫過程中起著重要作用，但是關于大豆SUS基因在逆境條件下的表達特性及其對大豆生長發育的影響目前還不清楚。因此，加強對菜用大豆SUS基因的研究不僅對于提升菜用大豆蔗糖品質具有重要意義，而且對于增進人們對菜用大豆的產量生理、籽粒發育調控和逆境脅迫響應等領域具有重要價值。目前相關研究仍需繼續深入，研究成果可能為將來菜用大豆品質和抗逆育種提供重要的基因信息。

轉化酶(INV)是一個催化不可逆反應的酶，能將蔗糖分解成果糖和葡萄糖。根據其最適pH可分為兩種類型：中性/堿性轉化酶(NI)，其最佳pH為7.0～7.8，位于細胞質中，也稱為細胞質轉化酶(cytoplasmic invertase，CIN)，CIN通過調節植物體內己糖的積累水平間接調控蔗糖的代謝，對于維持體內糖和活性氧平衡具有重要作用[66]；而酸性轉化酶(acid invertase，AI)的最佳pH為4.5～5.5，包括緊密結合在細胞壁的細胞壁轉化酶(cell wall invertase，CWIN)和存在于液泡中的液泡轉化酶(vacuolar invertase，VIN)[67]，CWIN在韌皮部卸載和庫發育中具有重要作用，VIN一般有利于糖積累和細胞擴增[68]。菜用大豆籽粒灌漿過程中不同部位AI活性變化較大，只有種皮中AI活性變化與種皮蔗糖積累的相關性達到顯著水平且活性顯著高于其他部位，但未引起相同時期種皮蔗糖含量變化，所以推斷種皮是AI發揮調節蔗糖在庫端的卸載和轉運功能的主要場所，這與種皮高度維管化有關。菜用大豆籽粒不同組織的NI的活性差異較小，且變化趨勢相似，在灌漿初期活性高并隨著籽粒的成熟呈一直下降趨勢[15]。

蔗糖在成熟葉片(源)中合成后，進一步轉運到異養組織(庫)中以滿足植物生長發育的需要。高等植物體內蔗糖的跨膜運輸及其在植物中的分配需要依賴于膜上的蔗糖轉運蛋白(Sucrose/H+symporters，也稱Sucrose/H+cotransporters或Sucrose/H+transporters，SUCs或SUTs)[69]。SUC/SUT家族屬于主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MFS)，包括SUT1、SUT2、SUT3、SUT4和SUT5 5個亞家族[70]。目前，在高等植物中已克隆到80多個SUC/SUT基因，其中在擬南芥中克隆了9個SUC基因，分別屬于SUT1、SUT2和SUT4 3個亞家族[71]，T-DNA插入AtSUC2后，突變體植株營養組織內有大量蔗糖和淀粉沉積，而將AtSUC2重新導入突變體植株后，營養組織內蔗糖與淀粉的轉運水平均恢復正常[72]；抑制馬鈴薯中StSUT1的表達，可引起塊莖變小且數量減少，成熟葉片中糖分積累增加[73]，因此SUC/SUT基因與蔗糖的運輸和碳分配密切相關，對作物的產量和品質具有重要的調控作用[74]。在菜用大豆籽粒發育過程中，蔗糖結合蛋白2(sucrose-binding protein 2，SBP 2)前體的上調表達可能有助于提高菜用大豆籽粒的營養品質和食味品質，表明蔗糖轉運蛋白可能對菜用大豆蔗糖的調控起著重要的作用[75]。張玉梅等[76-77]分別以擬南芥蔗糖轉運蛋白Q39232和O80605在大豆基因組數據庫進行同源比對，獲得了其中的兩條SUT序列，在菜用大豆閩豆6號中克隆得到了GmSUT和Glyma18g15950，其中GmSUT與大豆參考基因組Williams 82中的Glyma10g36200相似性達到99.98%，屬于MFS超家族，與綠豆(Vignaradiatavar.radiata)的親緣關系最近，同源性達93.28%，將該蛋白與擬南芥的9個SUC蛋白比對表明GmSUT與AtSUC2的親緣關系最近，屬于SUT1亞族；而Glyma18g15950蛋白屬于MFS-2超家族，Glyma18g15950與AtSUC3的親緣關系最近，屬于SUT2亞族。研究結果為進一步研究蔗糖轉運蛋白表達分析及功能驗證提供了理論參考[77]。

植物果實蔗糖積累受一系列因子如蔗糖的合成、運輸、分配及在果實中的代謝等的共同作用，其中蔗糖在果實中的分解強度是增強庫強、提高糖卸載能力、保證新合成的蔗糖由源到庫不斷運輸的重要環節，源庫之間蔗糖濃度的梯度差將調節籽粒中蔗糖的輸入速率[78]。在菜用大豆籽粒發育早期，即花后30 d之前，SUS的活性以分解方向為主，INV也維持較高活性，SPS活性雖緩慢上升，但整個蔗糖代謝酶系統的凈活性為負值，蔗糖代謝以分解為主，使籽粒維持較低水平的蔗糖濃度，形成源庫之間的濃度梯度，促進蔗糖向籽粒轉運；到花后30～36 d，籽粒發育至中期，SUS合成方向活性迅速升高，分解方向活性持續下降，同時INV也維持在較低活性，總體蔗糖代謝相關酶的凈活性為正值，蔗糖代謝以合成為主，蔗糖含量顯著升高；開花36 d之后籽粒發育進入后期，蔗糖分解速率開始加快，形成的單糖為籽粒蛋白質和脂肪等貯藏物質的快速合成提供了充足的碳源[49]。菜用大豆籽粒中蔗糖的含量并非受某一種酶絕對調控，當種皮中AI活性不高時，源端輸入的蔗糖不能及時分解而轉運到籽粒中，會導致SPS催化的底物缺失而降低活性，致使籽粒中蔗糖含量下降；在SUS活性較高時，籽粒中蔗糖分解速度加快，雖然不利于蔗糖的積累，卻加大了源庫兩端蔗糖的梯度差，從而促進蔗糖向籽粒的運輸。不同菜用大豆品種相關酶基因的表達存在明顯差異，因此，在選育品種時應注意，蔗糖代謝關鍵酶活性在合成和分解兩個方向上均較高的品系更有潛力發展成高蔗糖含量品種[15]。

3 菜用大豆蔗糖含量遺傳改良發展展望

傳統育種方法對于培育和改良菜用大豆品質做出了突出貢獻。但由于菜用大豆蔗糖含量屬于由多基因控制的復雜數量性狀，表型受環境效應的影響很大，傳統育種存在的選擇效率低、育種周期長和成本高等缺點，難以滿足人們對高品質、多樣化的菜用大豆品種的需求，因此，迫切需要對傳統育種技術進行改進。借助分子標記輔助選擇、重組DNA技術、基因編輯和多組學技術(基因組、轉錄組、蛋白組、代謝組、離子組)等現代育種技術，是未來大幅提升菜用大豆的品質和產量的重要途徑[79]。

3.1 通過全基因組選擇的方法加速菜用大豆蔗糖相關的微效基因的聚合

由于目前已經定位的不同QTL在不同的親本組合和環境中的效應值具有較大差異，因此，要成功將前人已報道的分子標記應用于自己的育種過程，必須充分考慮作圖群體、表型測定方法、重復和環境、遺傳分析方法、遺傳變異的豐度等多種因素，并進行獨立驗證實驗，當一個與原始群體至少有一個共有親本的獨立群體，在一個獨立的環境中對一個QTL進行評估時，實驗誤差<0.01時才能確認這個QTL的有效性[80]。同時，菜用大豆蔗糖含量相關的主效位點較少，且效應值不大，可能還受到許多未檢測出來的微效基因的控制，因此，育種中既要注意主效位點的利用，又要考慮微效多基因的積聚。僅有與菜用大豆蔗糖含量連鎖的標記是不夠的，一個完整的育種計劃還需要農藝性狀的標記資料和合理的育種設計，包括回交代數、每個世代需要保留的個體數等等，最好有一張高密度的分子遺傳圖譜，可以進行全基因組選擇[81]。RTM-GWAS方法能夠相對全面地解析植物種質/育種群體數量性狀的QTL體系，其檢測結果可以全面反映群體數量性狀遺傳構成，從而能夠進一步從全基因組QTL水平對育種親本組合進行潛力預測及優化組合設計，基于QTL-allele矩陣，可通過設計分子標記進一步應用于雙親后代選擇，從而提高選擇效率、縮短育種周期[82]。

3.2 解析蔗糖與其他相關性狀之間的遺傳關系，實現菜用大豆食味品質的協同改良

一般來講，菜用大豆品質性狀相關QTL具有多效性，彼此緊密連鎖[29，33]，品質相關的不同性狀之間往往存在負相關的關系，若提高某一物質含量往往以犧牲另一重要性狀為代價，要通過傳統育種手段實現品質改良，往往顧此失彼。例如，菜用大豆蔗糖含量與蛋白質含量之間具有顯著負相關性(r=-0.424，P<0.05)[11]，蔗糖相關的主效QTL同時也與蛋白質含量緊密連鎖[33]，在提高蔗糖含量的同時往往會導致蛋白質含量的降低[33]。在進行菜用大豆蔗糖含量QTL分析時，可同時對與蔗糖緊密相關的多個性狀進行研究，尋找具有協同增效或對其一增效對其他性狀無減效的QTL或分子標記，通過分子標記輔助選擇，實現菜用大豆品質性狀的協同改良[83]。關聯性狀間的條件QTL分析可以對緊密相關的性狀間的遺傳關系進行分解，從單個QTL或基因水平上探索兩性狀間緊密相關的內在遺傳基礎[84]，區分一因多效或多因一效對目標性狀的影響，尤其重要的是可以鑒定對某一性狀具有正效應但同時對與其負相關的性狀無負效應的重要QTL/基因，對打破許多重要農藝性狀間顧此失彼的矛盾有非常重要的意義，目前該方法在菜用大豆籽粒硬度的遺傳基礎研究中已經被報道[85]。

3.3 充分利用最新的分子生物學手段，實現菜用大豆蔗糖含量的精準改良

而近年來，隨著大豆基因組數據的逐步完善及分子生物學的發展，使大豆基因的克隆不再困難。目前在擬南芥、煙草等模式植物上，通過基因調控手段來改變組織中蔗糖含量已經有很多研究[86]。在菜用大豆品質改良方面，若能通過克隆其蔗糖代謝途徑關鍵基因，調控其表達模式，或許會具有更明顯的實際應用效果[25]。近年來，基于CRISPR-Cas9系統對植物基因組的編輯簡單易行、成本低、突變效率高，能夠實現多個基因同時編輯，是生物技術的重大突破，它的應用使得基因功能研究和作物遺傳改良等領域飛速發展[87]。隨著基因編輯技術的不斷進步，大豆分子設計育種迎來高速發展的階段，我們應當把握機遇，充分利用豐富的種質資源去解析遺傳調控網絡，定位和克隆功能基因，運用基因編輯技術對目標基因進行定點修飾及編輯，加速驗證其功能，深入解析菜用大豆蔗糖代謝相關的調控網絡和分子機制，最終實現菜用大豆蔗糖含量以及食味品質的精確改良[88]。