金寨縣桑黃的菌種鑒定與生長特性研究

程安東，汪本勤

(六安職業技術學院，安徽 六安 237158)

桑黃別稱桑耳、桑臣、桑黃菇、胡孫眼、松根等，在東亞、非洲、中美洲地區均有分布，一般寄生于桑屬的植物上，生長后期子實體呈黃褐色，因而得名“桑黃”[1]，在兩千多年前中國最早的中藥學專著《神農本草經》、唐初藤權的《藥性論》、唐代蘇敬《新秀本草》、明代李時珍的《本草綱目》中均有記載[2]。現代桑黃研究興起于第二次世界大戰之后的日本，由于美國對日本廣島和長崎投放原子彈致使當地居民受核輻射影響，患癌人數增加，而長崎女島的癌癥病例明顯低于廣島和長崎的其他區域，日本學者調查發現主要是由于當地居民服用了島上桑樹生長的桑黃，隨后日本學者在1968年通過試驗發現桑黃具有明顯的抗腫瘤功效[3]。

在分類學上桑黃屬于真菌界(Fungi)擔子菌門(Basidiomycota)蘑菇綱(Agaricomycetes)銹革菌目(Hymenochaetales)銹革菌科(Hymenochaetaceae)，Phellinus、Inonotus和Fomitiporia等屬的桑黃在文獻中均有出現。為了明確桑黃屬的劃分，戴玉成教授通過大量的研究將20個Phellinus屬的小種組成一個亞屬Fuhifomes，戴玉成教授還通過對比P.baumii與P.linteus的桑黃標本，認定傳統中藥“桑黃”的拉丁學名為Phellinusbaumii，并對P.baumii-P.linteus類群中所有種的劃分做了一些調整，將有些原來隸屬Phellinus屬的種劃分到了Inonotus屬[4-7]。目前在藥用桑黃菌種類中認定I.linteus、I.baumii、I.vaninii、I.lonicerinus、I.lonicericola、I.sanghuang、I.tenuicontextus、I.weigelae、I.weirianus這9種桑黃屬于藥用真菌桑黃類群[8]。

目前，桑黃作為珍貴的傳統藥用真菌被人們越發受到重視，國內外研究人員對桑黃的藥理作用進行了非常多的研究，桑黃是目前國際上公認生物治癌藥劑中最為高效的一種藥用真菌[9-11]，此外桑黃還具有調解免疫功能、抗氧化等作用[12-13]。近年來，桑黃菌在醫藥制劑與保健品行業的需求量越來越大。在皖西大別山的金寨縣永福桑黃菌種植合作社培育了大量的桑黃菌，其種類仍未能得到鑒定，筆者采集了其種植的桑黃子實體帶回實驗室進行分離純化培養，通過ITS序列分析將菌種鑒定為瓦寧木層孔菌(Sanghuangporusvaninii)即楊樹桑黃。

瓦寧木層孔菌俗稱楊黃，因其常見于山楊(Populusdavidiana)樹干上，因而得名楊黃。吳聲華等[3]在2020年發表文章將瓦寧木層孔菌歸類為擔子菌門(Basidiomycota)蘑菇綱(Agaricomycetes)銹革菌目(Hymenochaetales)銹革菌科(Hymenochaetaceae)桑黃孔菌屬(Sanghuangporus)，并對中國桑黃產業的發展指明方向，認為桑樹桑黃及楊樹桑黃在藥用桑黃種類中都應該得到認可與推廣。瓦寧木層孔菌主要的藥用成分為子實體，是一種桑黃類藥用真菌[14-15]，該菌最早報道出現在1960年的俄羅斯遠東，1993年在我國長白山自然保護區發現該菌，隨后又在黑龍江的小興安嶺以及東烏蘇里江與興凱湖之間完達山老爺嶺等地區被發現[16]，韓國、朝鮮、日本也有分布[17]。雖然楊樹桑黃的藥理成分及功效比桑樹桑黃略差[6]，但介于桑樹桑黃的難培養及生長條件苛刻且市場價格約是楊樹桑黃的10倍等因素，楊樹桑黃目前占據中藥桑黃的大部分市場。

本研究以六安市金寨縣永福桑黃菌種植專業合作社提供的桑黃菌株JS-1菌株為實驗材料，對其生長特性進行研究，為進一步探究瓦寧木層孔菌的藥用成分、快速繁殖、發酵生產及藥用開發等提供幫助。

1 材料與方法

1.1 供試菌株來源

供試桑黃菌株JS-1由金寨縣永福桑黃菌種植專業合作社提供，在六安職業技術學院植物病理實驗室進行分離、純化、形態學鑒定以及保藏。

1.2 供試培養基與分離、培養與保藏

首次分離選用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基：馬鈴薯200 g，無水葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，自來水1 000 mL，pH自然。對采集的子實體在無菌操作臺上，使用75%乙醇棉球擦拭子實體表面，進行殺菌消毒，無菌的解剖刀由菌傘向基部切開，用無菌的接種鉤在切面中線距離菌傘表面1/3處勾取一小塊組織，迅速的插入培養基表面，密封后放置于26 ℃恒溫培養箱中黑暗培養。組織塊菌絲萌發后，挑取菌落邊緣的菌絲進行進一步純化培養。待菌絲長滿平面1/3后將培養皿轉移至4 ℃冰箱內避光保存。

1.3 菌株及菌絲的形態學觀察

將分離純化的菌株在溫度為28 ℃恒溫黑暗培養箱內用PDA培養基培養，觀察菌落生長過程中形態顏色變化特征；使用插片培養法在顯微鏡下觀察菌絲形態特征并拍照記錄。

1.4 桑黃菌rDNA-ITS序列擴增與親緣關系構建

將分離得到的菌株在PDA培養基上培養7 d，將收集的菌絲置于1.5 mL的離心管，迅速放入液氮速凍，加入石英砂手工研磨。加900 μL的2% CTAB和90 μL的10% SDS。振蕩使其充分混勻，60 ℃水浴1 h，期間不時地顛倒EP管，然后12 000×g離心10 min。將上清液移至新的EP管中，加700 μL酚氯仿異戊醇，充分混勻，12 000×g離心10 min。取上清550 μL移至新的EP管加入550 μL氯仿，充分混勻。12 000×g離心10 min。取450 μL上清液，加入900 μL無水乙醇，混勻在-20 ℃沉淀30 min，12 000×g離心10 min。棄上清，加800 mL 75%乙醇洗滌，12 000×g離心5 min。棄上清，控干管內水分。37 ℃放置10 min。加20 μL無菌水，現加入1 μL RNase液，37 ℃酶解1 h。電泳檢測質量，保存于-20 ℃冰箱待用。

PCR反應程序采用94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，32個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用AXYGEN凝膠純化試劑盒回收DNA片段，連接到T載體上，轉至大腸埃希菌JM109中，PCR陽性檢測后送南京擎科生物公司測序。測序結果在GenBank 中進行序列比對并下載相關序列，利用DNAMan進行比對分析，用MEGA 6.0軟件構建系統進化樹。同時將桑黃菌株JS-1的ITS序列與GenBank中已經登錄的其他桑黃菌株的ITS序列進行比對，構建系統發育圖。

1.5 選擇基礎培養基

PDA培養基：200 g馬鈴薯(去皮)，20 g葡萄糖，15 g瓊脂，3 g KH2PO4，1 000 mL水，pH自然。玉米綜合培養基：20 g玉米粉，20 g葡萄糖，1 g KH2PO4，15 g瓊脂，1 000 mL水。木生菌標準培養基：20 g葡萄糖，10 g蛋白胨，2 g酵母膏，1 g KH2PO4，15 g瓊脂，1 000 mL水。配置好3種基礎培養基，用高壓滅菌鍋滅菌后，在無菌工作臺上進行倒板。用直徑為5 mm的滅菌打孔器在母種菌落邊緣打取菌餅，將菌餅有菌絲的一面朝下放置于3種基礎培養基平板上，密封后置于28 ℃恒溫黑暗培養箱中培養，每隔24 h觀察記錄3種培養基中菌落的直徑，每種基礎培養基設5個重復。菌絲的日平均生長速度=[菌落直徑(mm)-菌餅直徑(mm)]/生長時間(d)，篩選出最適宜菌株生長的基礎培養基。

1.6 菌株JS-1生長條件優化的單因素試驗

1.6.1 篩選菌絲生長最適溫度

以PDA培養基作為基礎培養基測定溫度對菌絲生長的影響，用直徑為5 mm的滅菌打孔器在母種菌落邊緣打取菌餅，將菌餅有菌絲的一面朝下接種于培養基平板的中央，密封后分別置于不同溫度的恒溫黑暗培養箱中培養，溫度設置在5～40 ℃，先每隔5 ℃設置一組試驗，每隔24 h用十字交叉法測量菌落直徑，找出峰值區間后再每隔1 ℃設置一組試驗。每個溫度處理下設置3組重復。

1.6.2 篩選菌絲生長最適pH

用濃度5 mol·L-1的HCl和NaOH溶液將PDA培養基的pH調成3、4、5、6、7和8、9、10、11、12，用滅菌打孔器打取直徑為5 mm的菌餅，菌絲一面朝下接種在不同pH的培養基中央，后放置于28 ℃恒溫黑暗培養箱中培養，用十字交叉法每隔24 h測量菌落直徑，觀察菌落形態。每個pH處理設置3組重復。

1.6.3 篩選最佳碳源與氮源

將PDA培養基中的葡萄糖去除作為基礎培養基，用來篩選最適宜菌種生長的碳源。用蔗糖、半乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖、甘露糖、纖維乙糖作為碳源對比葡萄糖作為碳源對菌落生長的影響。將PDA培養基中的馬鈴薯浸汁去除作為基礎培養基，用來篩選最適宜菌種生長的氮源。用蛋白胨、牛肉浸膏、玉米粉、硝酸鈉、酵母浸膏作為氮源對比馬鈴薯浸汁作為氮源對菌落生長的影響。用打孔器打取直徑為5 mm的菌餅接種于含不同氮源和碳源的基礎培養基中央，放置于28 ℃恒溫黑暗培養箱中培養，用十字交叉法每隔24 h測量菌落直徑，觀察菌落形態。每組處理設置3組重復。

1.7 不同培養因子對JS-1菌絲生長影響的正交試驗

為了考慮不同生長條件因子間的交互作用，依據上節篩選出單因子結果，以溫度、pH和不同質量濃度的碳源、氮源進行L9(34)正交試驗，試驗的各因子及水平見表1，依據菌絲的生長速度為指標，篩選最優生長條件組合，每組試驗設計6組重復。

表1 桑黃菌株JS-1最適生長條件的正交試驗因素與水平

1.8 測定菌絲的致死溫度

在28 ℃培養7 d的菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，分別放置在含有3 mL無菌水的試管中，搖晃均勻，在恒溫水浴鍋中靜置10 min，放入冰水中快速冷卻至常溫，接種于PDA培養基上，28 ℃恒溫黑暗培養，觀察菌絲生長情況。水浴鍋的溫度設置在40～60 ℃先以5 ℃為間隔，再以1 ℃為間隔進行試驗。每組處理設置3組重復。

1.9 統計學分析

試驗中所有測得數據采用SPSS 21.0統計軟件進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 桑黃菌株JS-1子實體生長環境與形態、菌落與菌絲形態觀察

桑黃菌株JS-1子實體生長環境及形態如圖1所示，子實體有菌蓋無菌柄，外形呈馬蹄形，基部較厚外緣薄，生長初期子實體為乳黃色，成熟后顏色變深呈黃褐色，表面粗糙，外緣新生部位呈金黃色，縱切后菌肉木質化，呈暗黃色軟木狀。

圖1 JS-1子實體生長環境與形態特征

如圖2所示，JS-1菌落為圓形，生長初期菌絲白色，呈絨毛狀沿著接種塊向外輻射狀生長，可見邊緣絨毛狀，中心部分出現一個小凸起。顯微鏡下觀察菌絲發達，細長，菌絲表面相對光滑，無色透明，頂端頓圓，有不明顯的分隔；生長旺盛期菌落呈乳黃色，邊緣新生菌絲為白色，顯微鏡下菌絲密集，少有分支；生長中后期菌落中心部位開始老化，呈黃褐色軟木狀，有明顯環紋，外圈呈乳黃色，顯微鏡下觀察菌絲膨大呈干癟狀，少量菌絲形成凸起。

A，生長初期菌落(3 d)；B，生長旺盛期菌落(10 d)；C，生長中后期菌落(15 d)；D，生長初期菌絲；E，生長旺盛期菌絲；F，生長中后期菌絲；G，老熟菌絲.

2.2 桑黃菌株JS-1 rDNA-ITS序列擴增及結果分析構建親緣關系圖

JS-1的rDNA-ITS序列長度為462 bp，參照吳聲華等[3]對桑黃孔菌屬種類的劃分，用BLAST軟件在GenBank中與已經登錄的其他桑黃孔菌屬菌株的rDNA-ITS序列進行比對，結果表明，菌株JS-1的rDNA-ITS序列與GenBank中登錄號為HQ845055.1的Sanghuangporusvaninii菌具有100%的相似性。通過系統發育樹分析表明，所得桑黃菌與Sanghuangporusvaninii同源性最高，遺傳距離最近，位于系統發育樹的同一分支，如圖3所示。結合JS-1的形態特征，以及rDNA-ITS序列分析結果，判定所得桑黃應為瓦寧木層孔菌Sanghuangporusvaninii，即楊樹桑黃。

圖3 基于rDNA-ITS序列構建菌株JS-1的系統發育樹

2.3 桑黃菌株JS-1在3種基礎培養基上生長狀況

將JS-1在3種基礎培養基上28 ℃黑暗培養3、7、10、15、20 d，菌株生長狀況及生長速度如圖4與表2所示。從圖4可以明顯看出，JS-1菌株在PDA培養基上的長勢最好菌絲濃密且茂盛，木生菌標準培養基上雖然菌絲生長速度最快但菌絲密度小于PDA培養基且菌落呈暗黃色，在玉米粉綜合培養基上的長勢最差，雖然菌絲生長速度較快，但是菌絲非常稀疏且在培養皿表面匍匐生長，因此，選擇PDA培養基作為JS-1基礎培養基。

表2 JS-1在3種基礎培養基上生長情況

2.4 不同生長條件因子對JS-1生長影響的單因素試驗

2.4.1 溫度對JS-1菌絲生長的影響

以PDA培養基作為基礎培養基培養7 d后發現，菌株在5～35 ℃區間均可生長，40 ℃時菌株停止生長，如表3所示。結果顯示，在5～28 ℃，菌落的生長速度隨溫度的升高而升高，且各組處理之間存在顯著差異；溫度在28 ℃時，菌落的生長速度最快，溫度在35 ℃處理條件下菌絲生長緩慢，且菌落顏色呈純白色。結果表明，溫度為28 ℃時最適合JS-1菌絲的生長。

表3 JS-1不同溫度條件下生長情況

2.4.2 pH對JS-1菌絲生長的影響

以PDA培養基作為基礎培養基培養7 d，結果顯示，pH在4～10菌絲均可生長，如表4所示。當pH為3、11、12時菌株停止生長。當pH為7時，菌絲生長速度最快。結果表明，pH為7時最適合JS-1菌絲的生長。

表4 JS-1不同pH值條件下生長情況

2.4.3 不同碳源培養基對JS-1生長的影響

以PDA培養基去除葡萄糖作為基礎培養基，將JS-1菌株接種至含不同碳源的培養基上培養7 d，結果如表5所示，在所選擇的7種碳源中，最適合瓦寧木層孔菌生長的碳源為葡萄糖，菌絲呈現乳黃色，濃密且茂盛，其次為蔗糖、半乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖、甘露糖、纖維乙糖。結果表明，JS-1菌株對葡萄糖的利用率最高。

表5 不同碳源對JS-1生長的影響

2.4.4 不同氮源培養基對JS-1生長的影響

以PDA培養基去除馬鈴薯浸汁作為基礎培養基，添加不同的氮源培養7 d，結果如表6所示，在所選擇的6種氮源中，以蛋白胨為氮源的培養基上菌落生長速度最快，且生長速度高于其他氮源，菌絲呈淡黃色，生長濃密但不茂盛；以馬鈴薯浸汁為氮源的培養基上菌落生長速度略慢于蛋白胨和玉米粉浸汁，但其長勢最為茂盛，菌絲呈乳黃色，如圖5中A、B、C所示。且在培養15 d后，以馬鈴薯浸汁為氮源的培養皿上最先出現黃褐色軟木狀環紋，如圖5中E、F、G所示，玉米粉浸汁、牛肉浸膏、硝酸鈉、酵母浸膏為氮源時，菌絲生長較慢或稀疏，不利于菌株的生長。結合菌絲生長速度及菌落長勢，認為馬鈴薯為JS-1生長最適氮源。

A，蛋白胨(7 d)；B，玉米粉浸汁(7 d)；C，馬鈴薯浸汁(7 d)；D，牛肉浸膏(7 d)；E，蛋白胨(15 d)；F，玉米粉浸汁(15 d)；G，馬鈴薯浸汁(15 d)。

表6 不同氮源對JS-1菌絲生長的影響

2.5 不同培養因子對JS-1菌絲生長影響的正交試驗

通過對不同培養因子及其水平的正交試驗，結果如表7所示。從結果極差可以得到對桑黃菌株JS-1菌絲生長影響程度的條件依次為pH(D)>溫度(C)>馬鈴薯(B)>葡萄糖(A)，結合圖6得到JS-1菌絲生長速度最快的組合為A2B1C3D3，即培養基中葡萄糖20 g·L-1，馬鈴薯使用量100 g·L-1，pH為8，培養溫度30 ℃。

表7 不同培養因子對JS-1菌絲生長影響的正交試驗結果

2.6 JS-1菌絲致死溫度測定

結果顯示，JS-1菌絲塊放入41～44 ℃水浴鍋處理后接種于PDA培養基上，均可生長。如圖6所示，43 ℃處理培養3 d后菌絲能正常生長呈淡黃色，44 ℃處理后菌絲生長速度較慢呈白色，45 ℃、46 ℃處理后菌絲不能生長，測定45 ℃為JS-1菌絲的致死溫度。

圖6 正交試驗9組設計菌落長勢

3 結論與討論

桑黃作為一種名貴且有效的藥用真菌，以其顯著的抗腫瘤功效，近年來越發被人們所重視，目前市場上的大部分桑黃分成兩類，即桑樹桑黃(Sanghuangporussanghuang)和楊樹桑黃(Sanghuangporusvaninii)，桑樹桑黃目前還很難栽培，且只生長于活桑樹上，由段木或袋料培養桑樹桑黃子實體比較困難，目前市面上所謂的栽培桑黃子實體，大都是楊樹桑黃[3]。目前，楊樹桑黃藥理成分及抗腫瘤功效已得到驗證[18-19]，其提取物的抗氧化能力也相對其他桑黃菌株較強[20]，考慮其栽培容易，生產成本較低等特點，我們應認同且接受楊樹桑黃在桑黃類藥用真菌中的價值，并對其藥用價值予以肯定。本研究對金寨縣永福桑黃菌種植專業合作社栽培的桑黃鑒定為瓦寧木層孔菌(Sanghuangporusvaninii)即楊樹桑黃，并以菌絲的生長速度和長勢為指標，進行了單因素試驗和正交試驗，明確菌株JS-1最適的生長溫度為28 ℃，最適pH為7，葡萄糖為碳源時菌絲生長速度以及菌落長勢最好，在氮源的選擇上觀察了接種后培養20 d內菌絲長速及菌落長勢情況，對比發現馬鈴薯浸汁為其生長的最適氮源。通過正交試驗，以菌絲的長速為指標，得到最優的培養條件為葡萄糖20 g·L-1，馬鈴薯100 g·L-1，pH為8，培養溫度為30 ℃，但是在實際培養當中發現當溫度條件達到30 ℃的組合菌落的茂盛程度均較低，與單因素試驗相一致，考慮該菌種對于溫度較為敏感，在正交試驗結果的基礎上以28 ℃培養最為合適。本研究結果與其他已有報道的桑黃菌種培養條件存在一定的差異，可能是培養的菌株種類不同，且試驗過程中不能單一的以菌絲的生長速度為指標，應結合菌落長勢進行分析，呂英華等[21]針對裂蹄木層孔菌(Phellinuslinteus)的培養基配方進行了正交試驗優化，認為玉米粉為其生長最適氮源，且生長濃密茂盛；曹春蕾等[22]對桑木層孔菌(Phellinusmori)進行研究發現，最適氮源為酵母浸膏，用淀粉為碳源時菌絲長速最快但菌落稀疏，以葡萄糖為碳源時長勢最好；宋吉玲等[23]對桑樹桑黃(Sanghuangporuesanghuang)通過正交試驗研究發現可溶性淀粉為碳源蛋白胨為氮源在30 ℃條件下培養最適合，且沒有提到30 ℃培養時菌落長勢是否茂盛；可見，菌種不同其生物學特性也是各不相同的，且正交試驗篩選出來的最優組合是在以菌絲生長速度為基礎上篩選出來的，其菌落長勢沒有考慮進去，因此并不能確定為最優組合，在實際生產中要同時考慮菌絲長速以及菌落長勢。

圖7 不同溫度處理后生長情況

綜上所述，通過本研究優化了楊樹桑黃的人工培養方法，為栽培楊樹桑黃和提高其產量提供幫助，希望在將來能夠將桑黃這一珍貴的藥用真菌推廣種植，為人類的大健康事業造福。