豬精原干細胞體外培養體系的建立

張 茂，趙 鑫，蔡更元，楊化強，*

(1.韶關學院 英東生物與農業學院，廣東 韶關 512005；2.華南農業大學 動物科學學院 國家生豬種業工程技術研究中心，廣東 廣州510642)

精原干細胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是體內唯一能將遺傳信息傳遞給下一代的干細胞，哺乳動物精子發生的維持取決于精原干細胞的存在[1-2]。哺乳動物精子發生是體內細胞連續增殖和分化過程中最復雜和漫長的過程之一，從精原干細胞到減數分裂，到精子形成需要一個多月的時間[3]。它依賴于精原干細胞的自我更新來維持足夠數量，同時又能分化為成熟精子，哺乳動物睪丸中精原干細胞持續分化產生精子這一過程貫穿著整個雄性的生命過程。精原干細胞的研究在轉基因動物的制備、輔助生殖、瀕危物種保存等方面具有重要意義。

在成年小鼠生殖細胞中僅有0.02%～0.03%的比例是精原干細胞，家畜睪丸中精原干細胞也是同樣有限的，所以在研究精原干細胞之前分離純化出高純度、活力好的精原干細胞是有必要的。分離精原干細胞的依據是睪丸中各種細胞的大小、比重、貼壁能力和表面抗原不同，目前純化精原干細胞的方法有差速貼壁法、密度梯度離心法、免疫磁珠分選法(MACS)、流氏細胞分選法(FACS)等[4-6]。研究人員利用差速貼壁方法使豬UCHL-1陽性的生殖干細胞從5%提高到了16%[7]。Izadyar等[8]利用差速貼壁分選的方法從3～7月齡牛的睪丸中分離出純度大于50%的精原干細胞。研究人員利用Percoll液從山羊睪丸中分離到未分化的精原干細胞，同時發現精原干細胞最高比例及最低比例的Percoll組分分別為20%和32%[9]。2004年Kubota等[10]利用MACS法得到高純度的Thy-1標記的小鼠生殖細胞，2014年Conrad通過CD49f磁性激活細胞分選分離出人精原細胞[11]。精原干細胞的標記物是將其區別于其他體細胞的標志，在鼠精原干細胞中已經有很多分子標記被證明，如Gfra-1[12]、Thy-1[13]、CD9[14]、PLZF[15]和Nanos2[16]等。與嚙齒類動物相比，對家畜類動物精原干細胞標記的認識相對有限，然而還是有一些標記被證明，如UCHL-1[17-18]、DBA[19]、Thy-1[20]等，這些標記的發現有助于家畜動物精原干細胞的純化和鑒定。

精原干細胞的體外培養不僅為精子發生的研究提供了基礎，還有助于開發新的家畜保存方法和動物遺傳修飾。研究人員發現，GDNF的調控決定精原干細胞的命運，過量表達導致未分化精原干細胞的積累，為精原干細胞進行體外培養提供了非常有價值的參考[21]。Kanatsu-Shinohara等[22]將新生小鼠睪丸分離出的精原干細胞在含有細胞因子GDNF、EGF、bFGF、LIF的條件下培養增殖超過5個月。在新生豬睪丸精原干細胞的體外培養中，添加EGF和bFGF對精原干細胞樣集落的數量和大小具有積極作用[23]。通過添加生長因子(GDNF、bFGF、EGF和LIF)也促進了羊A型精原細胞的增殖[24]。研究人員采用不同濃度的FBS培養豬、羊的精原干細胞時發現低濃度1%的FBS有利于精原干細胞的增殖[7，25]。

目前嚙齒類動物精原干細胞的培養體系較為成熟，而在家畜類大動物上未能實現長期培養，繼續探索出家畜動物精原干細胞最佳培養體系仍然是一個重要的研究方向。本研究嘗試不同差速貼壁程序純化大白仔豬精原干細胞，采用不同細胞因子組合探索有利于大白仔豬精原干細胞增殖的培養體系，以期建立豬精原干細胞的體外培養體系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3～7日齡的大白仔豬睪丸，取自溫氏食品集團種豬科技有限公司水臺繁殖場。

1.2 主要試劑

DMEM、DPBS、DMEM/F12(1∶1)、胎牛血清FBS、0.25% 胰酶、雙抗(青-鏈霉素)、HBSS緩沖液購自Gbico(美國)公司；膠原酶Ⅳ購自Sigma(上海)公司；明膠、細胞因子LIF(Millipore)、細胞因子GDNF、bFGF、IGF及絲裂霉素C購自優寧維生物(上海)；Anti-Mouse IgG Alexa Flour 488購自Cell Signaling(美國)；一次性尼龍細胞篩40 μm購自BD(上海)公司；DNase、反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 購自寶生物工程(大連)有限公司；實時熒光定量PCR試劑PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix購自Life(美國)公司；PCR酶2×EasyTaq?PCR SuperMix(+dye)購自北京全式金生物；培養細胞RNA提取試劑盒(Omega)購自廣州飛揚生物工程公司；UCHL-1抗體購自Proteintech(廣州)公司；免疫染色固定液、免疫染色通透液(Triton X-100)、QuickBlock免疫染色封閉液、免疫染色洗滌液、QuickBlock免疫染色一抗稀釋液、QuickBlock免疫染色二抗稀釋液、DAPI染色液、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒、MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒均購自碧云天(上海)生物；引物合成由深圳華大基因有限公司合成。

1.3 樣品采集

用酒精棉對3～7日齡的大白仔豬陰囊及周圍擦拭消毒后進行閹割，輕輕拉出睪丸放入含2倍雙抗的DPBS中清洗一遍，沖洗后浸泡于含2倍雙抗DMEM的離心管中放入泡沫盒盡快帶回實驗室，在泡沫盒中放入冰袋保持低溫。

1.4 睪丸單細胞懸液的制備

在超凈臺中進行操作，取出睪丸用DPBS清洗3次，然后將睪丸浸泡于75%的醫用酒精5 min，DPBS清洗3次，用高壓滅菌過的剪刀剪去附睪及睪丸白膜，DPBS清洗3次，然后用新的剪刀將睪丸剪碎，加入1 mg·mL-1膠原酶Ⅳ水解液于37 ℃培養箱中15 min，期間多次進行晃動，DPBS清洗3次，1 000 r·min-1離心5 min，小心去除上清。加入胰蛋白酶水解液于37 ℃ 10 min，期間進行多次晃動，加入10% FBS的培養基終止消化，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入完全培養基(含10% FBS、1%雙抗、DMEM/F12)重懸細胞，經40 μm細胞篩過濾后鋪于10 cm的培養皿中進行差速貼壁。

1.5 差速貼壁

將明膠溶液3 mL加入10 cm培養皿，使液面全部覆蓋培養皿底部，放于37 ℃ 5%的CO2培養箱中放置2 h，用前去除明膠，DPBS洗3次。將過篩的單細胞懸液鋪于明膠包被的培養皿中，采用不同的差速貼壁程序(A，2 h-2 h-3 h；B，2 h-2 h-1h；C，2 h-2 h)純化精原干細胞，每次差速貼壁培養后輕輕將懸浮細胞轉移到新的培養皿中，根據需要的差速貼壁次數重復以上操作，差速貼壁程序結束后進行培養過夜即可得到一定比例的精原干細胞。

1.6 免疫熒光檢測及堿性磷酸酶AKP檢測

將差速貼壁后培養皿內的細胞培養液輕輕倒掉，用4%多聚甲醛免疫染色固定液固定30 min，加入免疫染色洗滌液洗滌3次，每次5 min，加入免疫染色通透液(Triton X-100)室溫10 min，PBS洗1次后，加入QuickBlock免疫染色封閉液，室溫10 min。PBS洗3次，每次5 min。QuickBlock免疫染色一抗稀釋液以1∶200倍稀釋抗體UCHL-1，然后覆蓋于細胞，4 ℃孵育過夜。免疫染色洗滌液洗滌3次，每次5 min。加入1∶500倍稀釋的二抗Anti-Mouse IgG(Alexa Flour 488)，覆蓋住全部細胞，用錫箔紙將培養皿包住保證不透光，37 ℃孵育2 h。免疫染色洗滌液洗滌3次，每次5 min。加入適量的DAPI染色液完全覆蓋，避光下室溫10 min。然后PBS洗滌3次，每次5 min，熒光顯微鏡下進行觀察。細胞計數，差速貼壁試驗重復3次，每次試驗隨機選6個視野進行陽性細胞計數，計算出精原干細胞的比例。

堿性磷酸酶AKP檢測參照碧云天BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒步驟進行，用4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min，PBS洗3次，每次5 min，按說明書配制成BCIP/NBT染色工作液，最后一次PBS洗滌完畢后，去除洗滌液，加入適量BCIP/NBT染色工作液，確保能充分覆蓋樣品，室溫避光孵育1 h，去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸餾水洗滌1～2次終止顯色反應。

1.7 精原干細胞的體外培養

將第一次差速貼壁分離得到的支持細胞作為飼養層細胞，將其傳代于96孔板，分別加入含5、10、15、20 μg·mL-1絲裂霉素C的培養基處理3 h，培養24、48、72、96 h后分別用MTT法檢測細胞增殖情況，具體方法參照MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒方法進行，根據測定結果選擇合適濃度絲裂霉素C來處理支持細胞制備飼養層細胞。

將精原干細胞接種于飼養層細胞上，為了進一步探索不同生長因子組合對豬精原干細胞培養的影響，分別添加以下生長因子組合：A組為GDNF 20 ng·mL-1；B組為GDNF 20 ng·mL-1、LIF 10 ng·mL-1；C組為GDNF 20 ng·mL-1、LIF 10 ng·mL-1、bFGF 20 ng·mL-1；D組為 GDNF 20 ng·mL-1、IGF 10 ng·mL-1、bFGF 20 ng·mL-1；培養1周后用MTT法檢測細胞增殖情況。

1.8 標記基因RT-PCR檢測

對培養的精原干細胞的標記基因進行RT-PCR檢測，按照培養細胞RNA提取試劑盒(Total RNA Kit I)步驟提取培養精原干細胞的總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser I進行反轉錄成cDNA后進行PCR擴增，檢測的基因及引物序列如表1。

1.9 熒光實時定量PCR檢測

提取睪丸單細胞懸液、差速貼壁后純化細胞的總RNA，然后反轉錄成cDNA，基因表達用PowerUpTMSYBR Master Mix及Applied Biosystems QuantStudio 7 Real-Time PCR System進行擴增，以GAPDH作為內參對照，檢測Dazl及UCHL-1的表達，相對表達量的計算用2-ΔΔCt方法。PCR反應程序是95 ℃ 10 min，40個循環(95 ℃ 15 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s)，95 ℃ 15 s，59 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。定量PCR引物如表1。

表1 引物設計

1.10 統計分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，每組至少包含3個重復，對照組和實驗組的數值進行獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異顯著(用*表示)，P<0.01表示差異極顯著(用**表示)；進行單因素方差分析(One-way ANOVA)時，P<0.05表示差異顯著(用不同字母a、b表示)。

2 結果與分析

2.1 精原干細胞的純化及檢測

經過不同時間程序差速貼壁后得到的細胞進行免疫熒光染色檢測，隨機選擇6個視野對總細胞及UCHL-1陽性細胞進行計數，計算出陽性細胞比例，結果顯示，方法A得到UCHL-1陽性細胞數最多，比例為18.59%±0.94%；方法B得到的UCHL-1陽性細胞比例為16.16%±1.58%；方法C得到UCHL-1陽性細胞比例最低為9.94%±1.36%(圖1-A)。通過AKP染色發現部分細胞能被染成深色(圖1-B)，而睪丸其他細胞不能被染色，證明分離的細胞經過純化后得到一定比例的精原干細胞。通過對差速貼壁前的睪丸單細胞懸液及貼壁后精原干細胞的分子標記基因Dazl、UCHL-1進行表達水平的檢測，結果顯示，差速貼壁后細胞Dazl、UCHL-1基因的表達量顯著高于差速貼壁前的睪丸細胞(P<0.01，圖1-C)。

2.2 不同細胞因子添加對精原干細胞的影響

分離的睪丸細胞懸液通過一次差速貼壁得到的支持細胞呈梭形或不規則形狀，進行培養傳代后增殖速度較快，通過不同濃度絲裂霉素C處理3 h后，于24、48、72、96 h檢測支持細胞的增殖情況，結果顯示，10、15、20 μg·mL-1的絲裂霉素C處理效果都優于5 μg·mL-1(P<0.05)，其他幾個濃度組之間無明顯差異，選擇低濃度10 μg·mL-1的絲裂霉素C來處理支持細胞作為精原干細胞培養的飼養層(圖2)。將精原干細胞接種到以支持細胞作為飼養層上，并在培養基中添加不同組合的生長因子，通過MTT法對細胞增殖分析得到B組(GDNF 20 ng·mL-1+LIF 10 ng·mL-1)、C組(GDNF 20 ng·mL-1+LIF 10 ng·mL-1+bFGF 20 ng·mL-1)、D組(GDNF 20 ng·mL-1+IGF 10 ng·mL-1+bFGF 20 ng·mL-1)的增殖效率顯著高于A組(GDNF 20 ng·mL-1)，其中D組增殖效果最佳(圖2)。

2.3 精原干細胞的體外培養

將分離后的精原干細胞接種到飼養層細胞上，在含1% FBS的培養基中加入細胞因子GDNF 20 ng·mL-1、IGF 10 ng·mL-1、bFGF 20 ng·mL-1進行培養，接種后的精原干細胞大多為分散的單個細胞(圖3-A)，培養到第6天時有小的細胞集落形成(圖3-B)，細胞增殖加快，隨著培養時間的延長細胞集落面積增大、數量加多，當培養到第15天時，視野中可以看到大批的細胞集落形成(圖3-C)。

A，接種的精原干細胞(200×)；B，培養6 d的精原干細胞(200×)；C，培養15 d的精原干細胞(100×)；D，培養15 d的精原干細胞集落(200×)。

2.4 增殖精原干細胞的檢測

對培養15 d后的精原干細胞進行免疫熒光檢測和AKP染色檢測，免疫熒光檢測結果顯示，UCHL-1抗體進行免疫熒光染色呈陽性(圖4-A)，AKP染色結果顯示，精原干細胞集落及分散的精原干細胞能被染成深色(圖4-B)；收集精原干細胞提取總RNA，然后進行定量PCR檢測及干細胞分子標記基因的RT-PCR檢測，以增殖前純化的精原干細胞作為對照，分析增殖后精原干細胞標記基因的表達情況，定量PCR結果顯示，DAZL及UCHL-1的表達量極顯著升高(P<0.01，圖4-C)；RT-PCR檢測結果顯示，增殖的細胞除了表達精原干細胞的標記基因UCHL-1、Gfra-1和Thy-1外，同時還表達干細胞標記基因Oct-4、Nanog及精原干細胞分化標志基因C-kit(圖4-D)。

A，UCHL-1免疫熒光(200×)，a1，常光，a2，UCHL-1染色。B，AKP染色(200×)。C，定量PCR檢測，**表示差異極顯著。D，RT-PCR檢測，M，DL2000；泳道1～7分別為GAPDH、UCHL-1、Gfra-1、C-kit、Thy-1、Oct-4、Nanog基因。

3 討論

家畜的精原干細胞跟小鼠一樣數量稀少，想要對精原干細胞進行深入的研究及操作需要分離或富集出高活力、高純度的精原干細胞。由于缺乏特定的表征、形態和生物學標記來明確鑒定精原干細胞致使不能分離出純度100%的精原干細胞進行體外研究。然而，通過各種體內和體外方法可以從睪丸細胞懸浮液中對精原干細胞進行相對富集[18]。在豬中，新生兒和青春期前的睪丸可作為生殖細胞獲得的首選來源，在這些發育階段精原干細胞是生精小管中唯一的生殖細胞類型。考慮到豬睪丸隨日齡增加不斷發育，睪丸細胞組成也變得更加復雜，會出現各級分化的精原細胞和精子，本研究選取3～7日齡的大白仔豬睪丸作為精原干細胞來源，此階段睪丸細胞類型少，精原干細胞所占的比例相對較大有利于精原干細胞的分離。

在進行睪丸細胞懸液制備中，膠原酶及胰酶分步消化的方法最為常用，然而研究人員通過一步酶消化結合機械搖動的方法進行了改善[26]。本研究采用兩步酶消化法進行水解，同時在水解過程中多次進行晃動，使其能夠充分水解出精原干細胞。通過純化可使精原干細胞的比例得到很大的提高，為進一步研究精原干細胞的生物學特性、增殖、分化等機理提供材料，然而不同的純化方法得到的純度不同，對細胞活力的影響也不同。精原干細胞表面標記物的發現為精原干細胞的富集提供了基礎，當使用FACS或MACS進行富集時，一些生物標記物在不同細胞產生差異從而進行有效分選，除以上兩種方法，通過常用的差速貼壁及密度梯度離心同樣能將精原干細胞進行有效富集[4]。由于差速貼壁方法操作簡單、對實驗條件要求不高、對細胞損傷小的特點，該種方法得到的精原干細胞更有利于后期的體外培養及精原干細胞移植，本研究采用差速貼壁的方法進行精原干細胞的純化，在純化過程中嘗試不同貼壁時間對純化結果的影響，結果顯示，2 h-2 h-3 h貼壁效果最好，UCHL-1陽性精原干細胞的比例為18.59%±0.94%，高于Zheng等[7]差速貼壁純化新生豬精原干細胞得到的結果5%～16%，后面我們將深入探索更佳的差速貼壁方法或結合其他技術提高純化后精原干細胞的比例。

精原干細胞識別的方法常用基于生物分子標記物的識別和精原干細胞的移植，不同物種之間的精原干細胞標記物有所不同。UCHL-1在青春期前的睪丸生殖細胞表達，而在其他體細胞中沒有表達，研究人員相繼在豬[17-18]、牛[27]、山羊[24]中證明了UCHL-1蛋白的表達，目前UCHL-1被認為是成功鑒定人、小鼠、牛、山羊、綿羊和豬精原干細胞的共同標記[28]，因此，本研究選用UCHL-1作為精原干細胞純化的標記物來進行免疫熒光檢測及基因表達分析。DAZL基因在雄性動物睪丸組織特異表達，在早期胚胎發育、初級精母細胞形成和分化及睪丸發育過程中精母細胞的減數分裂中發揮重要功能[29]，本試驗對培養前后細胞DAZL、UCHL-1基因的表達進行了分析，結果表明培養后的細胞DAZL、UCHL-1基因的相對表達量顯著提高，表明精原干細胞數量明顯增加，此外DAZL的相對表達量提高幅度較大，表明精原干細胞增殖的同時也大量分化成不同階段的生殖細胞。培養后的細胞經RT-PCR檢測到了UCHL-1、Gfra-1、C-kit、Thy-1、Oct-4、Nanog的基因的表達，表明精原干細胞在培養過程中經過了增殖及分化。

精原干細胞體外培養中需要考慮培養基、生長因子、血清及飼養層細胞等因素。首先，培養基對精原干細胞的長期培養具有重要意義。目前，DMEM(高葡萄糖)和DMEM/F12是家畜精原干細胞培養中使用最廣泛的培養基[19，30-33]，這兩種培養基具有通用性，同時價格易于承受使其被大多數實驗室使用。在小鼠精原干細胞培養方面，利用KSR培養基對精原干細胞的培養能夠實現其增殖[34]，然而在豬精原干細胞培養的使用效果還需要進一步探究。其次，血清和飼養層細胞在精原干細胞的培養中也不可缺少，血清可以補充基礎培養基中缺少的營養物質以供細胞增殖及分化，低濃度的血清能夠對精原干細胞的增殖起到穩定維持作用，而高濃的血清除了促進精原干細胞的增殖，同樣也能加快飼養層細胞的增殖及分化而不利于精原干細胞的增殖[25]。在動物活體睪丸中，支持細胞作為主要部分構成了精原干細胞的微環境，直接分泌或旁分泌產生某些因子，對精原干細胞的自我更新及分化有促進作用，因此，豬內源的支持細胞可作為其精原干細胞培養的飼養層細胞。此外，在精原干細胞體外培養過程中除了需要飼養層及培養基外，還需要添加一些生長因子促進細胞的生長，如GDNF、LIF、bFGF、EGF、IGF及SCF等，然而這些因子的不同組合對豬精原干細胞增殖效果也不同，需進行進一步探索。基于以上幾點，本研究采用DMEM/F12作為基礎培養基，低血清濃度1%進行添加及采用大白仔豬自身的支持細胞作為飼養層進行精原干細胞的體外培養。在支持細胞作為飼養層制備中，10 μg·mL-1的絲裂霉素C處理支持細胞可以得到較好效果。在很多研究中證實，在小鼠等物種中GDNF對精原干細胞的自我更新至關重要，在本研究中以GDNF為基礎聯合其他生長因子進行添加探究對豬精原干細胞增殖的影響，結果表明，GDNF聯合LIF、bFGF及IGF的添加下精原干細胞增殖效果都優于GDNF單獨添加，其中GDNF、bFGF、IGF三者的聯合添加效果最好，為大白仔豬精原干細胞體外培養提供了參考。同時在進行體外培養中，實現了精原干細胞的大量增殖，出現了大批的精原干細胞集落，并且可以維持15 d以上，下一步將繼續優化培養條件以期實現豬精原干細胞的長期培養。綜上所述，本研究以豬支持細胞作為飼養層，1%FBS的培養中添加生長因子20 ng·mL-1GDNF、10 ng·mL-1IGF、20 ng·mL-1bFGF的組合對大白仔豬精原干細胞進行培養的增殖效果最佳，用該體系對大白仔豬精原干細胞進行體外培養超過15 d，通過AKP染色、UCHL-1染色及RT-PCR檢測表明精原干細胞實現了大量增殖，表明已初步建立了大白仔豬精原干細胞的體外培養體系。