連城白鴨不同組織中主要礦物元素沉積規(guī)律與關鍵基因表達水平研究

白 皓，李瀟凡，仲 黎，宋倩倩，江 勇，張 揚，王志秀，徐 琪，常國斌，，陳國宏，，*

(1.揚州大學 農業(yè)科技發(fā)展研究院，教育部農業(yè)與農產品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 揚州 225009；2.揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009)

礦物元素是人體新陳代謝過程中不可或缺的營養(yǎng)元素。鎂元素參與人體新陳代謝過程[1]，鉀元素保障神經傳導功能正常運行[2]，鐵元素缺乏可導致缺鐵性貧血[3]，鋅元素在消滅體內病原微生物方面起重要作用[4]，硒元素缺乏可導致人體重要器官功能缺失[5]。這些礦物元素是維持生命以及正常新陳代謝所必需的物質，但人體自身不能合成，必須要從食物中獲取。我國是肉鴨生產和消費大國，2019年我國肉鴨出欄量43.8億只，約占全球的68%，總產值超過1 357億元[6]。鴨肉是人們生活中重要的肉類食品，是人體礦物元素的主要來源之一。連城白鴨作為我國優(yōu)良的地方鴨品種，具有獨特的“白羽、烏嘴、黑腳”的外貌特征，其肉質鮮嫩、味道鮮美，曾被評為“全國唯一藥用鴨”，富含人體必需的17種氨基酸和10種礦物元素。大量研究表明，礦物元素沉積受到一些正向和負向調控因子的影響。TRPM家族成員TRPM6、TRPM7是調控細胞Mg2+平衡的關鍵因子[7]；鈉鉀泵(Na+/K+-ATP酶)在調節(jié)血管張力和血壓方面起著重要作用，ATP1A1、ATP1B1基因對Na+/K+-ATP酶的活性具有一定的影響[8]；鐵蛋白重鏈多肽1(FTH1)基因具有較強的亞鐵氧化酶活性，可以儲存和釋放鐵元素[9]；谷胱甘肽過氧化物酶是動物體內最豐富的硒蛋白，該家族中的GPX1是第一個被鑒定的硒蛋白，與GPX4一起參與體內的抗氧化防御系統(tǒng)[10]；氧化磷酸化過程的關鍵酶是位于線粒體膜上的ATP合成酶[11]，Zn+被認為是ATP受體的調制物[12]，而ATP6和ATP8是重要的線粒體基因。

鴨肉不僅能夠提供人體所需的多種礦物元素，而且與肉鴨自身的生長性能、肉品質、飼料轉化率以及抗病能力密切相關。因此，研究鴨肉中的礦物元素沉積對促進肉鴨生產和提高鴨肉品質具有重要意義。本研究以連城白鴨為研究對象，探究了不同組織中的主要礦物元素隨日齡增加的沉積規(guī)律以及相關基因的mRNA表達水平，為優(yōu)質肉鴨的選育指標和選育效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗選用150只0日齡的連城白鴨(公母各半)為研究對象，設置5個圈即5個試驗重復，每個重復30只，公母混養(yǎng)。采用上網下床模式飼養(yǎng)至63日齡。所有試驗鴨飼養(yǎng)管理條件相同，溫度、濕度等環(huán)境因素相同，試驗期間自由采食和飲水。不同飼養(yǎng)階段供給的日糧配方及飼料營養(yǎng)水平見表1。在試驗開始前，對鴨舍進行通風和嚴格的消毒，定期按照常規(guī)的免疫程序對試驗鴨進行免疫接種，試驗至63日齡結束。

1.2 樣品采集

在0、21、35、49和63日齡時，每個重復隨機挑選公母鴨各1只(共10只)，采集胸肌、腿肌、肝臟、背皮(背部脊骨正中間)和脛骨5種組織樣品，每種組織采集5 g樣品于-20 ℃保存，用于礦物元素含量測定。采集肝臟組織樣0.5 g，放入裝有RNA保護液的離心管中，于-80 ℃保存，用于RNA提取。

1.3 礦物元素測定指標與方法

1.3.1 組織前處理

將試驗鴨胸肌、腿肌、肝臟和背皮組織樣加入濃硝酸和過氧化氫中，在消解儀中高壓消解樣品，隨后放入加熱爐中除去硝酸，最后加入超純水定容，完全溶解之后進行檢測。剝取試驗鴨右側整條脛骨，用去離子水沖洗后再用濾紙吸干，隨后放在70～80 ℃恒溫鼓風干燥箱中烘干，烘干后用研缽研碎，放入干燥器中保存?zhèn)溆谩５V物元素檢測前處理的實驗步驟參照國標GB/T 9695.19—2008(鐵、鎂、鋅)和參考文獻[13-14](鉀、硒)，并根據(jù)國標方法在實驗儀器上進行改進，使用微波消解儀進行消解。

1.3.2 礦物元素含量測定

利用AFS-2202a原子熒光光度計(揚州大學測試中心)測定待測樣品中鎂、鉀、鐵、鋅和硒的含量。儀器條件：霧化器流量0.80 L·min-1，輔助氣流量0.20 L·min-1，等離子氣流量15 L·min-1，射頻發(fā)生器功率1.3 kW，樣品提升量1.5 mL·min-1。

1.4 引物設計

根據(jù)NCBI網站上綠頭野鴨中TRPM6、TRPM7、ATP1A1、ATP1B1、FTH1、GPX1、GPX4、ATP6和ATP8基因的mRNA序列，利用NCBI網站設計所有引物。引物由南京擎科生物科技有限公司合成(表2)。

表2 qRT-PCR引物序列

1.5 總RNA提取

采用天根公司的TRizol試劑盒，根據(jù)說明及步驟提取肝臟組織總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，使用NanoDrop 2000核酸濃度測定儀檢測總RNA的濃度和純度(D260/D280=1.8～2.1)，最后用TE將樣品稀釋至相同濃度。

1.6 cDNA合成

根據(jù)天根公司的反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。反應體系為20 μL：總RNA 2 μL(500 ng·μL-1)，5×FastKing-RT SuperMix 4 μL，RNase-Free ddH2O 14 μL補至20 μL。混勻后于42 ℃反應15 min，95 ℃反應3 min，反轉錄產物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 qRT-PCR

根據(jù)ABI實時熒光定量PCR的步驟和要求配置反應體系：cDNA模板2 μL，PoweUpTMSYBRTMGreen master Mix(2×)5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，ddH2O 2.2 μL補至10 μL。反應條件：95 ℃ 2 min；然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)，最后做熔解曲線收集信號的程序為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s和60 ℃ 15 s。擴增結束后進行熔解曲線分析，每個樣品設3個重復，取平均值。

1.8 統(tǒng)計分析

使用Excel 2016軟件對表型和qRT-PCR結果進行數(shù)據(jù)整理，基因相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算[15]。采用SAS 9.4軟件分別對礦物元素含量和基因表達量數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并采用Duncan法進行多重比較分析；采用Bivariate Correlation分析各礦物元素之間以及目的基因相對表達量與礦物元素含量之間的相關性，結果以平均值±標準差進行表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同組織中礦物元素沉積規(guī)律分析

不同日齡連城白鴨組織中礦物元素的沉積規(guī)律見圖1，在胸肌組織中，鎂和鉀元素的沉積規(guī)律基本一致，表現(xiàn)為隨日齡增加呈顯著性(P<0.05)升高的趨勢，兩種元素在49～63日齡時的含量達到峰值；鐵元素的沉積規(guī)律表現(xiàn)為先下降再升高再下降的趨勢，在49日齡時的含量顯著高于其他日齡(P<0.05)；鋅元素的沉積規(guī)律表現(xiàn)為隨日齡增加呈顯著性(P<0.05)下降的趨勢；硒元素在0日齡時的含量最高(P<0.05)，其他日齡含量一致。

A，胸?。籅，腿??；C，肝臟；D，背皮；E，脛骨。鎂元素、鉀元素、鐵元素和鋅元素含量單位是mg·kg-1，硒元素含量單位是μg·kg-1。標有不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

在腿肌組織中，鎂和鉀元素的沉積規(guī)律與在胸肌組織中的沉積規(guī)律基本一致，表現(xiàn)為隨日齡增加呈顯著性(P<0.05)升高并在49～63日齡時穩(wěn)定沉積的趨勢；鐵元素的沉積規(guī)律表現(xiàn)為0～49日齡穩(wěn)定沉積并在63日齡時呈顯著性(P<0.05)升高的趨勢；鋅元素的沉積規(guī)律與在胸肌組織中的沉積規(guī)律完全相反，表現(xiàn)為隨日齡增加逐漸升高的趨勢，在63日齡時的含量達到峰值(P<0.05)；硒元素的沉積規(guī)律表現(xiàn)為波動性沉積，在35日齡時的含量最高。

在肝臟組織中，5種礦物元素的沉積規(guī)律均表現(xiàn)為隨日齡增加呈顯著性(P<0.05)升高的趨勢。其中，鐵元素在連城白鴨21～49日齡生長階段的肝臟中快速沉積，達到峰值(P<0.05)。

在背皮組織中，5種礦物元素的沉積規(guī)律與上述3個組織有所不同。鎂和鉀元素的沉積規(guī)律基本一致，表現(xiàn)為隨日齡增加呈顯著性(P<0.05)下降的趨勢；鐵元素的沉積規(guī)律表現(xiàn)為在所有日齡穩(wěn)定沉積，無顯著性差異(P>0.05)；鋅元素的沉積規(guī)律表現(xiàn)為0～21日齡顯著性(P<0.05)升高、21～49日齡顯著性(P<0.05)下降、49～63日齡顯著性(P<0.05)升高的趨勢，在49日齡時的含量最低(P<0.05)；硒元素的沉積規(guī)律表現(xiàn)為0～35日齡顯著性(P<0.05)升高、35～63日齡顯著性(P<0.05)下降的趨勢，在35日齡時的含量最高(P<0.05)。

在脛骨組織中，鎂和鉀元素的沉積規(guī)律與在背皮組織中的沉積規(guī)律基本一致，表現(xiàn)為隨日齡增加呈顯著性(P<0.05)下降的趨勢，兩種元素在21日齡時的含量最高(P<0.05)；鐵元素的沉積規(guī)律表現(xiàn)為0～21日齡顯著性(P<0.05)升高、21～63日齡顯著性(P<0.05)下降的趨勢，在21日齡時的含量最高(P<0.05)；鋅元素的沉積規(guī)律表現(xiàn)為在所有日齡穩(wěn)定沉積，無顯著性差異(P>0.05)；硒元素的沉積規(guī)律表現(xiàn)為0～21日齡基本不變、21～49日齡顯著性(P<0.05)下降、49～63日齡穩(wěn)定沉積的趨勢。

2.2 不同礦物元素之間相關性分析

胸肌組織中礦物元素沉積相關性見表3。鎂元素與鉀元素在連城白鴨的5個生長階段均呈正相關，其中0和49日齡呈極顯著正相關(P<0.01)，21日齡呈顯著正相關(P<0.05)。在63日齡時，鐵元素與硒元素呈顯著正相關(P<0.05)。

表3 胸肌組織中礦物元素沉積相關性

腿肌組織中礦物元素沉積相關性見表4。鎂元素與鉀元素在5個生長階段均呈正相關，其中35和63日齡呈極顯著正相關(P<0.01)，0和21日齡呈顯著正相關(P<0.05)。同樣，鐵元素與鋅元素在5個生長階段均呈正相關，其中0、21和49日齡呈顯著正相關(P<0.05)。

表4 腿肌組織中礦物元素沉積相關性

肝臟組織中礦物元素沉積相關性見表5。鎂元素與鉀元素在5個生長階段均呈正相關，其中0日齡呈極顯著正相關(P<0.01)，21、49和63日齡呈顯著正相關(P<0.05)。同樣，鎂元素與硒元素在5個生長階段均呈正相關，其中21日齡呈極顯著正相關(P<0.01)，0和49日齡呈顯著正相關(P<0.05)。鉀元素與硒元素在5個生長階段均呈正相關，其中49日齡呈極顯著正相關(P<0.01)，0日齡呈顯著正相關(P<0.05)。另外，在21日齡時，鎂、鐵和硒元素分別與鋅元素呈顯著正相關(P<0.05)；在35日齡時，鎂和鉀元素分別與鋅元素呈顯著正相關(P<0.05)，鐵元素與硒元素呈顯著正相關(P<0.05)。

表5 肝臟組織中礦物元素沉積相關性

背皮組織中礦物元素沉積相關性見表6。鎂元素與鉀元素在5個生長階段均呈正相關，其中21～63日齡呈極顯著正相關(P<0.01)。在21日齡時，鎂、鉀、硒、鋅4個元素呈極顯著正相關(P<0.01)；在35日齡時，鎂和鐵元素分別與鋅元素呈顯著正相關(P<0.05)。

表6 背皮組織中礦物元素沉積相關性

脛骨組織中礦物元素沉積相關性見表7。鎂元素與鉀元素在5個生長階段均呈正相關，其中0、21和63日齡呈顯著正相關(P<0.05)。在35日齡時，鉀元素與硒元素呈顯著負相關(P<0.05)；在63日齡時，鎂和硒元素分別與鋅元素呈顯著負相關(P<0.05)。

表7 脛骨組織中礦物元素沉積相關性

2.3 基因表達水平及其與礦物元素之間相關性分析

2.3.1 基因表達規(guī)律分析

肝臟組織中礦物元素相關基因的表達規(guī)律見圖2。所有基因均以63日齡的表達水平作為對照組，比較不同日齡之間的基因表達差異。鎂元素相關基因TRPM6和TRPM7的表達規(guī)律基本一致，表現(xiàn)為0～21日齡升高、21～35日齡顯著性(P<0.05)下降、35～63日齡穩(wěn)定表達的趨勢，兩個基因在21日齡時的表達水平最高(P<0.05)；鉀元素相關基因ATP1A1和ATP1B1的表達規(guī)律基本一致，表現(xiàn)為隨日齡增加呈顯著性(P<0.05)下降再顯著性(P<0.05)升高的趨勢，兩個基因在0日齡時的表達水平最高(P<0.05)；鐵元素相關基因FTH1的表達規(guī)律表現(xiàn)為0～21日齡穩(wěn)定表達、21～35日齡顯著性(P<0.05)下降、35～63日齡顯著性(P<0.05)升高的趨勢，在35日齡時的表達水平最低(P<0.05)；鋅元素相關基因ATP6和ATP8的在0～21日齡時的表達規(guī)律相反，在21～63日齡時完全一致，ATP6基因在0日齡時的表達水平最高(P<0.05)，而ATP8基因在21日齡時表達水平最高(P<0.05)；硒元素相關基因GPX1和GPX4的表達規(guī)律均表現(xiàn)為先顯著性(P<0.05)下降再穩(wěn)定表達的趨勢，GPX1和GPX4基因均在0日齡時的表達水平最高(P<0.05)。

A，Mg; B，K; C，F(xiàn)e; D，Zn; E，Se.

2.3.2 基因表達與礦物元素之間相關性分析

由表8可知，所有元素相關基因的表達水平與元素在肝臟組織中的沉積量呈負相關，但不顯著(P>0.05)。

表8 基因表達量與肝臟組織中礦物元素的相關性分析

3 討論

為了滿足人們不斷提高的生活品質和消費需求，近年來優(yōu)質肉鴨的概念被提出，未來我國優(yōu)質肉鴨市場份額將會提升至50%～60%。優(yōu)質肉鴨因其富含各種營養(yǎng)物質和礦物元素而具有獨特的風味，但其體型較小，生長發(fā)育緩慢，飼養(yǎng)日齡較長。飼養(yǎng)日齡對肉鴨體內的礦物元素和營養(yǎng)價值均有顯著影響，是決定鴨肉品質的關鍵因素之一。然而，飼養(yǎng)日齡過長，則會導致飼料轉化率降低，飼養(yǎng)成本增加和經濟效益降低。因此，本研究可為優(yōu)質肉鴨的生長發(fā)育和礦物元素沉積規(guī)律提供基礎數(shù)據(jù)，也為優(yōu)質肉鴨科學合理的上市提供參考依據(jù)。

礦物元素作為機體酶、激素和維生素等生物活性物質的重要組成成分，參與一系列物質代謝和能量代謝過程，對動物機體的生長發(fā)育和肉品質改善具有重要的作用。鎂是動物機體生長發(fā)育不可缺少的元素之一，參與多種酶的催化，通過改變動物肌肉中的鎂元素沉積可以改善肉品質[16-17]。鉀是排在動物體內第三位的常量元素，是機體細胞內代謝的主要陽離子。細胞內的鉀主要功能是保持神經、肌肉的應激性和細胞活動的穩(wěn)定性[18]。鉀與其他離子一起激活和提高酶的活性，是酶促反應的主要離子，從而保證機體的正常且旺盛的代謝功能。鐵是人體內含量最高的必需微量元素，是氧的活化和傳輸所必需的一種重要元素，以多種形式存在于動物的機體中，參與整個機體的能量和蛋白質代謝。動物體內幾乎所有的器官都含有鐵，有約20%的鐵元素儲存于肝臟和脾臟中，肌肉與骨髓組織含鐵量較少，與本研究結果相同。鋅是必需微量元素中生理功能最廣泛的元素，與體內多種酶的活性有關，動物的采食、生長、繁殖、免疫以及機體的新陳代謝有鋅的參與[19]。鋅與白蛋白結合經血液循環(huán)首先運送到肝臟中，然后被分配到其他的組織器官里，大部分轉運到骨骼中[20]。硒是家禽必需的微量元素[21]，對動物機體的免疫應答、抗氧化、疫病預防和抗癌等有重要的作用[22]。硒主要分布在肝和腎中，與本研究結果相同。礦物元素之間存在相互協(xié)同和拮抗關系，直接影響了礦物元素的吸收乃至整個營養(yǎng)成分的代謝與利用。本研究結果表明，鎂與鉀元素的沉積規(guī)律在所有組織中基本一致，且在連城白鴨的5個生長階段均呈正相關，特別是在胸肌、腿肌和肝臟組織中隨日齡增加呈顯著性升高的趨勢。郭建鳳等[23]認為，鎂具有緩解動物應激、增強機體抗氧化能力、改善肌肉的嫩度及減少滴水損失等作用。李亮等[24]研究表明，鎂可有效地提高肉仔雞肌肉的抗氧化能力，提高肉品質，防止劣質肉的產生。同樣，鉀是動物體內的第三必需礦物質，是肌肉組織中第一必需礦物質。鉀可以促進氨基酸分子的吸收，尤其可以提高賴氨酸的利用率。鉀對豬肉的系水力很重要，可以降低白肌肉(PSE肉)的發(fā)生率[25]。因此，我們推測，連城白鴨體內的鎂元素和鉀元素相互協(xié)同，共同促進機體正常代謝，提高其肉品質，可作為聯(lián)合指標用于連城白鴨優(yōu)質品系的精準選育，提高選育效率。此外，5種礦物元素在不同組織中的沉積規(guī)律顯示，在胸肌、腿肌和肝臟組織中，幾乎所有礦物元素的含量在49～63日齡時達到峰值并趨于穩(wěn)定，為連城白鴨最佳出欄日齡的選擇提供基礎數(shù)據(jù)支撐。

研究表明，基因對礦物元素的沉積和代謝具有重要的作用。TRPM家族中的TRPM6、TRPM7基因對于Mg2+的穩(wěn)態(tài)維持有著及其重要的作用[26-27]。El-Mallakh等[28]研究表明，Na+/K+-ATP酶可維持機體的鈉離子和鉀離子平衡。當紅細胞中的Na+/K+-ATP酶活性降低時，ATP1A1可以將K+泵入細胞，將Na+泵出細胞，提高細胞中K+的濃度。He等[29]研究發(fā)現(xiàn)，鐵蛋白基因FTH1表達可以產生聚鐵效應，有利于鐵元素在動物體內的沉積。韓軍花等[30]研究發(fā)現(xiàn)，鋅對細胞膜的Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活性均有影響，鋅濃度過低或過高都可抑制酶活性。硒的代謝形式主要分為硒蛋白和含硒蛋白兩種，硒蛋白包括谷胱甘肽過氧化物酶，是動物體內最豐富的硒蛋白。該家族包含了5種類型，其中GPX1是體內重要的抗氧化防御系統(tǒng)，GPX4對生物膜有抗氧化保護作用[31]。研究發(fā)現(xiàn)，GPX1和GPX4基因的表達量與硒元素含量密切相關[32]。本研究中，相關基因的表達水平隨日齡呈動態(tài)變化，主要表現(xiàn)為先下降再升高的趨勢，與礦物元素在肝臟組織中的沉積量呈負相關。

4 結論

本研究以連城白鴨為研究對象，探究了不同組織中的主要礦物元素隨日齡增加的沉積規(guī)律以及相關基因的mRNA表達水平。鎂元素和鉀元素可作為聯(lián)合指標用于連城白鴨優(yōu)質品系的精準選育；49～63日齡可作為優(yōu)質連城白鴨最佳出欄日齡的參考日齡。本研究結果為優(yōu)質肉鴨選育指標和選育效率提供了一定的理論依據(jù)。