雜交鱘出血病病原的分離鑒定與組織病理學觀察

楊成年，李 芳，朱成科，唐征縣，易子琳，韓璐璐，陽龍江，彭小倩，賀 蝶，李 楊，任朝穎，呂光俊

(西南大學 水產學院/淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，重慶 402460)

鱘隸屬于鱘形目(Acipenseriformes)鱘科(Acipenseridae)鱘屬(Acipenser)，是分布在北美洲、亞洲和歐洲東部地區(qū)的一種亞冷水性魚類[1]。鱘肉厚味美，骨刺少，具有極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，尤其由鱘卵制作而成的魚子醬更有“黑色黃金”之稱[1-2]。我國于1956年首次攻克鱘人工繁殖技術，隨后在全國范圍內推廣養(yǎng)殖。歷經(jīng)多年發(fā)展，我國鱘養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，養(yǎng)殖種類包括西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)、施氏鱘(Acipenserschrenchii)、俄羅斯鱘(Acipensergueldenstaedtii)、雜交鱘(Acipenserbaerii♀×Acipenserschrenckii♂)等在內的多個品種，年產量超10萬t[3]。雜交鱘因具有生長速度快、抗病力強、成活率高的特點，成為我國主要鱘養(yǎng)殖品種，其產量占總產量的80%以上[4]。但近年來，隨著雜交鱘產業(yè)規(guī)?；?、設施化的發(fā)展，養(yǎng)殖過程中疾病頻發(fā)，尤其是細菌性疾病最為嚴重，阻礙鱘產業(yè)發(fā)展。目前已報道的細菌病病原主要包括海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)、溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、類志賀鄰單胞菌(Plesimonasshigelloides)等[5-6]。

2020年8月，重慶彭水某養(yǎng)殖場雜交鱘出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，發(fā)病初期表現(xiàn)為離群獨游、行動緩慢、食欲減退，腹部大面積充血、肛門紅腫，解剖可見病魚腹腔充盈血水、腸道充血紅腫、體腔內壁出血，發(fā)病率高達30%～40%，死亡率達10%～20%。為明確此次雜交鱘患病原因，本研究從患病雜交鱘肝中分離到一株優(yōu)勢病原菌CQST-2，通過形態(tài)學觀察、人工感染、生理生化特性測定、分子生物學方法對該病原菌進行鑒定，同時進行了毒力基因檢測與藥敏試驗，并對患病組織進行病理觀察，以期為該疾病的診斷和治療提供科學參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患病雜交鱘取自重慶市彭水縣某雜交鱘養(yǎng)殖場，養(yǎng)殖水溫20.0～21.0 ℃，pH值為7.6～8.2，溶氧5～8 mg·L-1，病魚體重為1.0～1.4 kg；用于人工感染的健康雜交鱘購買自重慶市豐都縣某鱘魚養(yǎng)殖場，體重80～100 g，暫養(yǎng)在控溫循環(huán)水養(yǎng)殖池，養(yǎng)殖期間水溫20～22 ℃，pH值為7.2～7.8，溶氧8.5～9.1 mg·L-1，暫養(yǎng)期間早晚各投餌1次，每2 d換水1次，每次換水量為總體積的1/3。

1.2 主要試劑與儀器

藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司；瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒，北京全氏金生物技術有限公司；細菌基因組提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；PCR反應試劑，日本Takara公司；pMD19-T，日本Takara公司；大腸埃希菌DH5α，日本Takara公司。

電泳儀，北京六一儀器廠；離心機5810R，德國Eppendef公司；PCR儀，美國Bio-Rad公司；微量核酸蛋白測量儀，美國Thermo Scientific公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；組織切片機，美國Thermo Scientific公司；光學顯微鏡，日本Olymplus公司。

1.3 病原菌的分離與培養(yǎng)

選取瀕臨死亡、癥狀明顯的病魚，在無菌條件下用接種環(huán)從病魚肝、脾、腎等組織取樣劃線接種在固體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征，革蘭氏染色后在光學顯微鏡下觀察細菌微觀形態(tài)。觀察并選取優(yōu)勢單菌落進行重復劃線純化，4 ℃保存待用。

1.4 人工感染試驗與半致死量LD50確定

挑取單個純化菌株CQST-2接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h后，用0.65% NaCl溶液洗脫并離心收集菌液，參照麥氏比濁法將細菌濃度依次稀釋為1.3×109、1.3×108、1.3×107、1.3×106CFU·mL-1菌懸液備用。撈取100尾健康魚后隨機分成4個試驗組，1個對照組，每組20尾。試驗組每條魚腹腔注射0.2 mL的菌液，對照組注射等量的0.65% NaCl溶液。試驗期間，水溫維持在(22±1)℃，正常投喂飼料，并定時記錄受試魚的活動與死亡情況。對人工感染后瀕臨死亡的雜交鱘再次進行病原菌的分離鑒定。

1.5 16S rRNA、gyrB、cpn60和rpoB基因擴增和測序

用細菌基因組提取試劑盒提取細菌總DNA。PCR反應體系設為50 μL，DNA模板1 μL，10×EasyTaqBuffer 5 μL，上下游引物各1 μL(引物見表1)[7-8]，dNTPs 4 μL，rTaq0.5 μL，ddH2O補足余量。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，16 ℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

將目的片段切膠純化，連入pMD19-T載體，轉化到大腸埃希菌DH5α，挑選陽性克隆送華大基因進行測序，測序序列運用Bioedit軟件進行比對，用MEGA7軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.6 細菌的致病因子

毒力基因檢測：按照文獻[7]和[9]選取并合成維氏氣單胞菌ompA、hly、aer、alt、act等5種毒力基因的引物(表1)。以上述提取的細菌DNA為模板進行PCR擴增，擴增產物經(jīng)電泳檢測后送華大基因進行測序，測序結果在GenBank中進行Blast比對。

表1 菌株CQST-2管家基因與部分毒力基因引物

1.7 病理組織

采用常規(guī)組織切片技術[7]，將患病雜交鱘肝、脾、腎、腸、鰓依次經(jīng)固定、乙醇梯度脫水、石蠟包埋、切片、染色、封片操作，顯微拍照觀察。

1.8 藥敏試驗

運用K-B紙片法檢測細菌的耐藥性[11]。取純化單菌落進行擴大培養(yǎng)，離心后用0.65%無菌NaCl溶液調整濃度為1.01×108CFU·mL-1，用無菌棉簽蘸取菌液后涂布在平板表面，然后用無菌鑷子夾取藥敏紙片并均勻貼于培養(yǎng)基表面，28 ℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈大小，根據(jù)藥品使用說明進行結果判定。

2 結果與分析

2.1 患病雜交鱘癥狀

患病雜交鱘表現(xiàn)為離群獨游、精神不振、行動緩慢、攝食減少、鰓絲發(fā)黑、下頜出血、腹部出血、腹鰭基部出血(圖1-A)；解剖后見肝出血(圖1-B)；腸道螺旋瓣出血(圖1-C)；腸道紅腫(圖1-D)；體腔內壁嚴重出血。

A，腹鰭出血；B，肝出血；C，腸道螺旋瓣出血；D，腸道紅腫。

2.2 病原菌形態(tài)特征

菌株CQST-2在BHI培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h后，形成肉眼可見、邊緣整齊、呈隆起狀、表面濕潤、直徑為0.12～0.53 mm的乳白色菌落。在光學顯微鏡下可見兩端鈍圓、單個或成對存在、大小約為1.52 μm×0.49 μm的革蘭氏陰性桿菌(圖2)。

A，菌落形態(tài)；B，微觀形態(tài)。

2.3 人工感染試驗與LD50

人工感染試驗表明，1.3×109CFU·mL-1菌液注射組試驗魚在2 d內全部死亡，1.3×106CFU·mL-1注射組試驗魚在7 d內的死亡率為10%，對照組試驗魚未出現(xiàn)死亡(表2)。感染死亡的雜交鱘臨床癥狀表現(xiàn)為胸鰭基部出血、腹腔充盈血水、腸道充血發(fā)紅等，此癥狀與自然狀態(tài)下的病癥相似；從人工感染瀕臨死亡的病魚肝中再次分離到的菌株，經(jīng)PCR擴增測序后鑒定為維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)。根據(jù)改良寇氏法計算得到菌株CQST-2對雜交鱘的LD50為2.0×105CFU·g-1。

表2 CQST-2人工感染試驗

2.4 病原菌CQST-2生理生化特性

從自然患病雜交鱘體內分離到的菌株可利用氧化酶、接觸酶、麥芽糖、吲哚、明膠、半乳糖等，對鳥氨酸脫羧酶陰性、賴氨酸脫羧酶陽性、精氨酸雙水解酶陰性(表3)。此結果與《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第8版)中維氏氣單胞菌的特性相似，初步鑒定為維氏氣單胞菌。從人工感染瀕臨死亡的雜交鱘體內分離到的菌株具有相似的生理生化反應(表3)。

表3 生理生化鑒定結果

2.5 基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育分析

用細菌16S rRNA、gyrB、rpoB、cpn60基因上下游引物擴增得到大小約為1 500、1 200、540、750 bp的片段，與預期結果一致，陰性對照組未擴增出相應的基因(圖3)。16SrRNA、gyrB、rpoB和cpn60基因與維氏氣單胞菌的同源性最高，構建的系統(tǒng)發(fā)育樹也與維氏氣單胞菌聚為一支(圖4，圖5)。以上鑒定結果表明，菌株CQST-2為維氏氣單胞菌。同時，對人工感染獲得的菌株進行16S rRNA、gyrB、rpoB、cpn60基因測序后，用Blast和MEGA7進行序列比對，結果表明，再分離的菌株與CQST-2相似率達100%。

M，DL2000 DNA marker; 1，16S rRNA; 3，gyrB; 5，rpoB; 7，cpn60; 2，4，6 and 8 were control group.

圖4 基于菌株CQST-2的16S rRNA基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 基于菌株CQST-2 gyrB-rpoB-cpn60聯(lián)合基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 細菌的毒力基因

通過PCR可擴增出大小約為1 000、250、500、300、600 bp的片段，擴增片段經(jīng)純化、克隆后進行測序，測序序列經(jīng)Blast比對，發(fā)現(xiàn)與維氏氣單胞菌的ompA、act、aer、hlyA、alt基因同源性最高。同時，以去離子水為模板未擴增出相應的基因(圖6)。由此表明，該菌株攜帶有ompA、act、aer、hlyA和alt基因。

M，DL2000 DNA marker; 1，ompA; 3，act; 5，aer; 7，alt; 9，hlyA. 2，4，6，8 and 10 were control groups.

2.7 病理組織切片

病理組織切片表明：健康雜交鱘肝結構清晰，肝小葉區(qū)分明顯，呈多角棱柱狀(圖7-A)；患病雜交鱘肝類纖維化變性，毛細血管破裂，肝血竇擴張充血，中央靜脈擴張充血，肝細胞輪廓結構模糊、界限不清，部分肝細胞核溶解或碎裂，更嚴重的則為細胞空泡變性，表現(xiàn)為細胞內含有大小不等的空泡(圖7-B)；健康雜交鱘脾紅髓和白髓分區(qū)明顯，細胞排列整齊(圖7-C)；患病雜交鱘脾組織紅細胞浸潤、胞質部分損傷、淋巴細胞聚集(圖7-D)；健康雜交鱘腎結構完整，腎小管間隙明顯(圖7-E)，患病雜交鱘腎小管上皮細胞腫脹，炎性細胞浸潤，部分腎小球萎縮變小(圖7-F)；健康雜交鱘腸結構完整，杯狀細胞排列清晰，結構完整(圖7-G，圖7-H)，患病雜交鱘肌肉層與漿膜層浸潤大量紅細胞，腸絨毛壞死、脫落，紋狀緣結構破壞(圖7-I，圖7-J)。健康雜交鱘鰓絲排列整齊有序(圖7-K)，患病雜交鱘鰓小片彎曲不規(guī)則、上皮細胞增生，增生處有淋巴細胞浸潤(圖7-L)。

A，為健康雜交鱘肝臟；B，患病雜交鱘肝臟，肝血竇淤血(箭頭)，肝細胞變性呈空泡化(▲)；C，為健康脾臟；D，脾臟充血(箭頭)；E，為健康雜交鱘腎臟；F，腎小球萎縮(箭頭)；G、I，為健康雜交鱘腸道；H，腸道充血(箭頭)；J，腸絨毛壞死脫落(▲)；K，為健康雜交鱘鰓；L，鰓小片部分上皮細胞細胞增生(▲)，紅細胞浸潤(箭頭)。

2.8 藥敏試驗

根據(jù)NCCLS抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準K-B紙片擴散法檢測菌株CQST-2對30種抗菌藥物的耐藥性試驗，具體結果見表4。該菌株CQST-2對氧氟沙星、氟苯尼考、多黏霉素B、環(huán)丙沙星、恩諾沙星等18種藥物高度敏感；對磺胺甲基異惡唑、紅霉素和慶大霉素3種藥物中度敏感；對麥迪霉素、吉他霉素、青霉素等9種藥物耐藥。

表4 CQST-2菌株的藥物敏感性

3 結論與討論

本研究從患病雜交鱘肝臟分離到菌株CQST-2，革蘭氏鏡檢為陰性，生化反應與維氏氣單胞菌較為相似，尤其是賴氨酸脫羧酶陽性、精氨酸雙水解酶陰性，這是維氏氣單胞菌的重要特征反應；雖然菌株對纖維二糖、山梨醇、肌醇特性與標準菌株具有一定差異性，推測造成這種差異的原因可能是來源不同的菌株由于地區(qū)、培養(yǎng)條件與氣候等不同引起的菌株適應性變化，并非種間區(qū)別，由此將其初步鑒定為維氏氣單胞菌[13-14]。為進一步確定其分類地位，本研究選用16S rRNA、gyrB、rpoB和cpn60基因進行鑒定。由于16S rRNA基因在細菌進化過程中具有高度保守性，有“分子化石”之稱，是判別細菌的常用指標，但是其對近緣種的分辨率不夠[15]。gyrB、rpoB和cpn60管家基因具有更高的替換率，彌補了同屬近緣種間分辨不足的缺陷，使得鑒定結果更具有可靠性和準確性[16]。故本研究在利用16S rRNA序列鑒定的基礎上，增加gyrB、rpoB和cpn60管家基因對菌株進化地位進行驗證。鑒定結果結合形態(tài)特征、生化特性，以及16S rRNA、gyrB、rpoB和cpn60基因序列分析，綜合判定為維氏氣單胞菌。

維氏氣單胞菌隸屬氣單胞菌科(Aeromonadaceae)、氣單胞菌屬(Aeromonas)，是一種廣泛存在于自然界的革蘭氏陰性桿菌[17]。由于其極強的環(huán)境適應性，逐漸成為人類、禽類和魚類的致病菌。研究發(fā)現(xiàn)，當人體感染維氏氣單胞菌時，可引起腹瀉、腦膜炎和敗血癥等疾病；當鴨抵抗力降低時，可引起腦血管充血、出血，嚴重時可導致死亡[18]。

此外，維氏氣單胞菌作為一種條件致病菌，可造成多種水生動物患病，如華鯪(Sinilabeodecorustungting)感染維氏氣單胞菌可表現(xiàn)為鰭條基部充血、肌肉出血等；當斑點叉尾鮰(Ictalunespunctatus)感染后，可表現(xiàn)為體表出血、臟器出血和腹腔積水等[19-20]。同時，國內外還有草魚(Ctenopharyngodonidella)[21]、金魚(Carassiusauratus)[22]、大口黑鱸(Micropterussalmoides)[23]、黃鱔(Monopterusalbus)[24]、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[25]等感染維氏氣單胞菌的報道。

維氏氣單胞菌的致病機制較為復雜，但普遍認為與其分泌的外毒素(exotoxin)、黏附因子(adherent factor)和胞外酶(exoenzyme)等有關。其中，外毒素在維氏氣單胞菌的發(fā)病機制中起到重要作用，如aer和hlyA是導致宿主組織廣泛出血和溶血的關鍵毒力基因[26]，aer、hly、alt、act和ast是導致宿主腸炎的基因等[27]。本研究通過PCR技術擴增出維氏氣單胞菌的ompA、hlyA、aer、alt、act基因，結合人工感染試驗，顯示分離菌株對雜交鱘有較強的致病性，可造成宿主體表充血、出血，內臟組織嚴重損害，這與文獻[25]和[28]報道的維氏氣單胞菌感染達氏鱘、西伯利亞鱘的癥狀相一致。雖目前已有維氏氣單胞菌感染雜交鱘的報道，但是缺乏相應病理變化的描述[29]。在本研究中，患病鱘肝、脾、腸出現(xiàn)不同程度的病變，肝細胞腫脹，廣泛空泡變性，嚴重的表現(xiàn)為核皺縮、溶解，這影響到肝物質交換和排出毒素的功能，最終導致肝中脂肪粒積累，可形成脂肪肝[25，30]；脾紅細胞浸潤、胞質部分損傷、淋巴細胞聚集，這與海豚鏈球菌感染鱘的病癥一致[31]。腸道病變最為明顯，腸絨毛壞死脫落，部分區(qū)域固有膜裸露，肌肉層充血發(fā)紅，這可能與維氏氣單胞菌產生毒素有關，從而損傷腸道結構，影響腸道吸收營養(yǎng)物質的功效。

藥敏試驗結果表明，從患病雜交鱘體內分離的維氏氣單胞菌CQST-2對氧氟沙星、氟苯尼考、多黏霉素B、環(huán)丙沙星、恩諾沙星等18種藥物高度敏感；對麥迪霉素、吉他霉素、青霉素等9種抗菌藥物表現(xiàn)耐藥。此試驗結果可為養(yǎng)殖場雜交鱘養(yǎng)殖生產過程中疾病的早期預防和治療提供科學依據(jù)。但該試驗結果與從草魚[32]、華鯪[18]、巖原鯉[8]、西伯利亞鱘[28]等體內分離到的維氏氣單胞菌的藥敏試驗結果有差異，可能與菌株來源不同，以及不同養(yǎng)殖場使用抗菌藥物情況不同等有關。因此，在進行抗菌藥物治療時，首先應參照致病菌株的藥敏試驗結果，同時結合無公害食品漁用藥物使用準則(NY 5071—2002)和農業(yè)農村部漁業(yè)漁政管理局印發(fā)的《水產養(yǎng)殖用藥明白紙2020年1、2號》等相關規(guī)定，選用國家允許、效果佳的抗菌藥物進行治療。