正交設(shè)計(jì)優(yōu)化中藥類植物提取物組方

陶 新，吳宛澐，孫雨晴，門小明，徐子偉

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

我國于2020年7月1日起全面禁止在畜禽飼料中添加促生長(zhǎng)類藥物添加劑，但特別提出“中藥類除外”，這為中藥類飼料添加劑的發(fā)展提供了全新的機(jī)遇。中藥類植物(含提取物)具有高效、安全、性價(jià)比高、無耐藥性、幾乎無殘留等優(yōu)點(diǎn)，在體內(nèi)具有獨(dú)特的作用模式，被稱為抗生素的“耐藥逆轉(zhuǎn)劑”[1]，是目前飼用抗生素替代品研究熱點(diǎn)之一。因此，中藥類植物提取物作為一種飼料添加劑，極有可能在“后抗生素時(shí)代”被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)豬生產(chǎn)，尤其是在對(duì)抗仔豬斷奶應(yīng)激方面將展現(xiàn)出更大潛力。我們前期以體外抑菌和抗氧化功能為評(píng)價(jià)指標(biāo)，制備出一種抑菌兼具抗氧化功能的復(fù)合植物提取物[2]，其對(duì)斷奶仔豬有較好促生長(zhǎng)作用，可完全替代飼用抗生素[3]；但因部分植物原料價(jià)格較高，限制了該產(chǎn)品的應(yīng)用前景。因此，本試驗(yàn)旨在通過豐富評(píng)價(jià)指標(biāo)、進(jìn)一步篩選“高效低價(jià)”的植物原料，利用正交設(shè)計(jì)制備出多功能、高性價(jià)比的新型復(fù)合植物提取物，為最終將其應(yīng)用于養(yǎng)豬生產(chǎn)替代飼用抗生素提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 中藥類植物原料

選取白術(shù)(Atractylodismacrocephalaerhizoma)、刺五加(AcanthopanacissenticosiRadixet Rhizome Seu Caulis)、甘草(Glycyrrhizaeradixetrhizoma)、桂枝(Cinnamomi Ramulus)、厚樸(Magnoliaeofficinaliscortex)、雞血藤(Spatholobicaulis)、絞股藍(lán)(Gynostemmapentaphyllum)、迷迭香(Rosmarinusofficinalis)、牛膝(Achyranthisbidentataeradix)、女貞子(Ligustrilucidifructus)、秦皮(Fraxinicortex)、青蒿(Artemisiaeannuaeherba)、石榴皮(Granati Pericarpium)、蚊子草[Filipendulapalmate(Pall)Maxim]、香附子(CyperusrotundusL.)、銀杏葉(Ginkgofoliumleaf)、淫羊藿(Epimediifolium)、茵陳蒿(ArtemisiaecapillarisThunb.)、澤漆(EuphorbiahelioscopiaL.)等19種中藥類植物原料，在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃烘干至質(zhì)量不變，粉碎過40目篩后，收集粉末樣品儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 中藥類植物提取物的制備

分別稱取各植物原料粉末樣品5 g，加入100 mL超純水，于80 ℃恒溫水浴鍋中密閉提取6 h，經(jīng)3層濾紙過濾后收集濾液，于60 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中濃縮至1 mg·μL-1，濃縮液經(jīng)0.22 μm過濾除菌后，制備的提取液于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 抑菌試驗(yàn)

受試菌為大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株C83912(購自中國獸藥監(jiān)察所)。

抑菌率測(cè)定參照周子雄等[4]方法：取100 μL提取液加入至4 mL無菌LB液體培養(yǎng)基中，混勻后接種40 μL濃度為108CFU·mL-1、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌懸液，充分搖勻后以100 μL加入至96孔酶標(biāo)板。空白對(duì)照用超純水替代提取液，陰性對(duì)照不接種細(xì)菌懸液以監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基污染情況。每個(gè)處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。將酶標(biāo)板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在SpectraMax多功能酶標(biāo)儀上于600 nm處檢測(cè)培養(yǎng)前吸光度(D0)和培養(yǎng)結(jié)束時(shí)吸光度(D24)，計(jì)算抑菌率。

最小抑菌濃度(MIC)采用微量稀釋法[5]：取提取液1 mL加入無菌LB液體培養(yǎng)基1 mL，接種40 μL濃度為108CFU·mL-1處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌懸液，充分混勻后進(jìn)行倍比稀釋，使提取液終濃度分別為500、250、125、62.5、31.25 mg·mL-1。空白對(duì)照用超純水替代提取液，陰性對(duì)照不接種細(xì)菌懸液以監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基污染情況。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以培養(yǎng)后未見細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為MIC值。

1.4 抗炎試驗(yàn)

采用5-脂肪氧化酶(5-LOX)活性抑制試驗(yàn)[6]測(cè)定植物提取液的抗炎活性：底物為含體積分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-20的5.4%亞油酸(用0.2 mol·L-1硼酸緩沖液配制，pH值為9.0)。將提取液與用超純水稀釋50倍的5-LOX以1∶20進(jìn)行混勻后，于30 ℃水浴30 min，加入7.5倍的底物30 ℃水浴3 min，用3倍無水乙醇終止反應(yīng)后，再加入等量超純水制備成待測(cè)液。取200 μL加入96孔酶標(biāo)板，于酶標(biāo)儀上檢測(cè)234 nm處的吸光度(Da)。空白對(duì)照用超純水代替提取液，且在加底物前用無水乙醇終止酶與底物反應(yīng)(吸光度記為Db)，陰性對(duì)照用超純水代替5-LOX(吸光度記為Dc)，陽性對(duì)照用超純水代替5-LOX(吸光度記為Dd)。計(jì)算抗炎率。每個(gè)處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。將提取液進(jìn)行倍比稀釋，至終濃度分別為100、50、25、12.5、6.25 mg·mL-1，按上述步驟檢測(cè)其吸光度。數(shù)據(jù)采用CurveExpert軟件擬合回歸方程，以對(duì)5-LOX活性抑制率達(dá)50%時(shí)的提取液濃度為抗炎IC50值。

1.5 抗氧化試驗(yàn)

采用2，2-二苯基-1-苦肼基(DPPH)自由基清除試驗(yàn)[7]測(cè)定植物提取液的抗氧化活性：用無水乙醇配制0.5 mg·mL-1DPPH溶液，4 ℃避光保存?zhèn)溆茫粚⑻崛∫哼M(jìn)行倍比稀釋至終濃度分別為100、50、25、12.5和6.25 mg·mL-1，取100 μL加入96孔酶標(biāo)板，加入等量DPPH溶液并充分混勻。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。37 ℃孵育30 min后于酶標(biāo)儀上檢測(cè)516 nm處的吸光度。空白對(duì)照用超純水替代提取液，陰性對(duì)照用無水乙醇替代DPPH溶液。數(shù)據(jù)采用CurveExpert軟件擬合回歸方程，以自由基清除率達(dá)50%時(shí)的提取液濃度為抗氧化IC50值。

1.6 正交試驗(yàn)

為進(jìn)一步提高復(fù)合植物提取物的抑菌、抗炎和抗氧化功能，以及明確各組分比例，采用正交試驗(yàn)法研究各植物原料及其不同劑量組合共同提取后的各生物活性。以抑菌率、抗氧化IC50值和抗炎率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)19種植物提取物的抑菌、抗炎和抗氧化試驗(yàn)結(jié)果，選取桂枝、石榴皮、青蒿、厚樸和雞血藤作為正交設(shè)計(jì)的5個(gè)試驗(yàn)因素，參照《中國藥典》各原料的用法用量，每種原料選取不同的4個(gè)劑量(g)作為正交設(shè)計(jì)的4個(gè)試驗(yàn)水平，采用L16(45)正交設(shè)計(jì)表，按表1所示條件進(jìn)行混合提取，優(yōu)選植物提取物組方。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用正交設(shè)計(jì)助手3.0設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表格、對(duì)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，利用Excel 2010軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素不同水平的方差分析，結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物提取物的抑菌、抗炎和抗氧化效果

由圖1可見，選取的19種植物提取物對(duì)大腸埃希菌抑制率存在較大差異，其中，石榴皮抑菌率最高，其次為桂枝，再次為青蒿，抑菌率均在50%以上。另外，甘草和銀杏葉的抑菌率均在30%以上，雞血藤、厚樸和刺五加的抑菌率在20%以上，其余提取物的抑菌率均低于10%。因此，復(fù)合植物提取物的候選組分選擇抑菌率較高的桂枝、石榴皮和青蒿為部分原料。

1，白術(shù)；2，刺五加；3，甘草；4，桂枝；5，女貞子；6，秦皮；7，青蒿；8，銀杏葉；9，厚樸；10，蚊子草；11，香附子；12，雞血藤；13，絞股藍(lán)；14，迷迭香；15，牛膝；16，石榴皮；17，茵陳蒿；18，淫羊藿；19，澤漆。下同。

抗炎試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，19種植物提取物中，石榴皮抗炎率最高，其次為雞血藤、厚樸和迷迭香，抗炎率均在90%以上，再次為蚊子草、澤漆、淫羊藿、茵陳蒿和桂枝，抗炎率均高于60%，其余提取物抗炎率均低于50%。同時(shí)，結(jié)合各原料性價(jià)比，綜合平衡后，復(fù)合植物提取物候選組分選擇抗炎率較高的石榴皮、雞血藤和厚樸為部分原料。

圖2 十九種中藥類植物提取物的抗炎率

DPPH自由基清除試驗(yàn)結(jié)果(圖3)表明，19種提取物的抗氧化IC50值介于0.085～188.9 mg·mL-1。其中，石榴皮抗氧化能力最強(qiáng)，其抗氧化IC50值低于0.1 mg·mL-1；其次為秦皮等12種提取物，抗氧化IC50值均低于15.0 mg·mL-1；牛膝抗氧化能力較差，IC50值高達(dá)188.9 mg·mL-1。

圖3 十九種中藥類植物提取物的抗氧化效果

因此，復(fù)合植物提取物的候選組分選擇抗氧化效果較高的石榴皮為部分原料。

綜上，復(fù)合植物提取物的候選原料組成最終確定為桂枝、石榴皮、青蒿、雞血藤和厚樸共5種植物。

2.2 植物提取物組方的優(yōu)化

由表2和表3可見，以抑菌功能為主的最優(yōu)提取物組合為A4B4C2D4E1，即厚樸、雞血藤、青蒿、桂枝和石榴皮的比例為7∶13∶6∶9∶1時(shí)，可獲得具有最佳抑菌功能的提取物組方(Fab)。極差分析結(jié)果表明，影響因素大小順序?yàn)槭衿?厚樸>雞血藤>青蒿>桂枝。

表2 正交試驗(yàn)中16種復(fù)合植物提取物的抑菌率、抗炎率和抗氧化IC50值

表3 正交試驗(yàn)中復(fù)合提取物的各評(píng)價(jià)指標(biāo)極差分析結(jié)果

以抗炎功能為主的最優(yōu)提取物組合為A4B4C1D1E1，即厚樸、雞血藤、青蒿、桂枝和石榴皮的比例為7∶13∶4∶1∶1時(shí)，可獲得具有最佳抗炎功能的提取物組方(Fai)。極差分析結(jié)果表明，影響因素大小順序?yàn)殡u血藤>石榴皮>厚樸>青蒿>桂枝。

以抗氧化功能為主的最優(yōu)提取物組合為A2B4C1D1E4，即厚樸、雞血藤、青蒿、桂枝和石榴皮的比例為3∶13∶4∶1∶7時(shí)，可獲得具有最佳抗氧化功能的提取物組方(Fao)。極差分析結(jié)果表明，影響因素大小順序?yàn)槭衿?桂枝>厚樸>雞血藤>青蒿。

2.3 各組分及其不同劑量對(duì)復(fù)合植物提取物抑菌、抗炎和抗氧化功能的影響

方差分析結(jié)果(表4)表明，無論是抑菌率、抗炎率還是抗氧化IC50值，各因素F值均大于0.01，P值均<0.001，表明厚樸、雞血藤、青蒿、桂枝和石榴皮等各因素對(duì)3項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)均具有極顯著影響。

表4 各因素方差分析結(jié)果

各因素不同水平間分析結(jié)果(表5)表明：對(duì)抑菌率而言，厚樸的1水平和2水平之間、3水平和4水平之間，雞血藤的1、2、3水平間無顯著差異(P>0.05)，其他各因素水平間均差異顯著(P<0.05)；對(duì)抗炎率而言，厚樸的3水平和4水平之間，雞血藤的2水平和3水平之間，青蒿的2水平和4水平、3水平和4水平之間，桂枝的3水平和4水平之間均無顯著差異(P>0.05)，其他各因素水平間均差異顯著(P<0.05)。對(duì)抗氧化IC50值而言，除了青蒿的1水平和3水平間無顯著差異(P>0.05)外，其他各因素的4個(gè)水平間均差異顯著(P<0.05)。

表5 各因素水平方差分析結(jié)果

2.4 植物提取物組方的抑菌、抗炎和抗氧化功能驗(yàn)證結(jié)果

采用微量稀釋法檢測(cè)Fab、Fai和Fao的最小抑菌濃度，結(jié)果顯示，3種復(fù)合提取物的MIC值均為125 mg·mL-1，表明3個(gè)組方具有同等抑菌效果。對(duì)5-LOX活性抑制試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，與Fab相比，F(xiàn)ai和Fao對(duì)5-LOX活性抑制率達(dá)50%的提取液濃度，即抗炎IC50值均顯著降低(P<0.05)，但Fai和Fao之間無顯著差異(P>0.05)(圖4-A)，表明Fai和Fao均具有較強(qiáng)抗炎活性。對(duì)DPPH自由基清除試驗(yàn)結(jié)果分析表明(圖4-B)，3個(gè)組方對(duì)自由基清除率達(dá)50%時(shí)的提取液濃度，即抗氧化IC50值大小順序?yàn)镕ai>Fab>Fao，且3個(gè)組方間均具有顯著差異(P<0.05)，提示3個(gè)組方相比，F(xiàn)ao具有最強(qiáng)抗氧化活性。

A，抗炎效果；B，抗氧化效果。柱狀圖中標(biāo)注不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)。

3 討論

已有研究表明，植物提取物在動(dòng)物體內(nèi)具有獨(dú)特作用模式，可發(fā)揮抗應(yīng)激、抗炎、促生長(zhǎng)、抗菌、抗病毒、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等作用，其活性成分主要包括多酚、多糖、黃酮、皂苷和有機(jī)酸等[8-11]。目前，植物提取物在仔豬上的應(yīng)用效果已初步顯現(xiàn)，如博落回、銀杏葉、甘草、止痢草、刺五加和連翹等提取物均被發(fā)現(xiàn)具有緩解斷奶應(yīng)激、改善健康和促生長(zhǎng)等作用[12-14]。但已有的提取物產(chǎn)品基本上都是從單種植物原料中提取，導(dǎo)致其生物活性成分含量較低、功能單一、效果不顯著等。另外，即使是復(fù)合的植物提取物，也大多存在組方過程不明，添加量過高和成本昂貴等問題。況且我國天然植物種類豐富，因此更多高效、廉價(jià)植物資源有待于被研發(fā)和應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)。

本研究首先根據(jù)已有報(bào)道選取了19種具有較強(qiáng)抑菌、抗炎和抗氧化效果的中藥類植物原料，在水溶液中提取后，通過研究其提取液對(duì)大腸埃希菌和5-LOX活性的抑制作用，以及對(duì)DPPH自由基清除效果分別表征其抑菌、抗炎和抗氧化功能。通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，從中遴選出石榴皮、桂枝、青蒿、厚樸和雞血藤5種植物作為復(fù)合植物提取物的原料組分。其中，有關(guān)石榴皮提取物研究較多，近年來其體內(nèi)外抑菌、抗炎和抗氧化活性在國內(nèi)外均不乏報(bào)道[15-16]。本試驗(yàn)中，石榴皮在19種植物提取物中具有最強(qiáng)抑菌、抗炎和抗氧化功能。我們先前研究也已證實(shí)石榴皮在另外17種植物提取物中具有最強(qiáng)抗氧化活性[2]。盡管如此，將石榴皮和另外3種植物分別提取后給小鼠灌胃，4種提取物對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能均無顯著促進(jìn)作用；而由同樣4種植物原料組合的復(fù)合提取物卻能顯著促小鼠生長(zhǎng)，具有抗氧化、抑菌和免疫增強(qiáng)效果[17]。一方面，這可能是由于植物種類不同，其有效活性成分也不同，使得復(fù)合提取物的生物活性成分在“質(zhì)”上提高；另一方面，復(fù)合植物在混合提取時(shí)發(fā)揮了中藥成分的“組合效應(yīng)”，使其生物活性成分在“量”上增強(qiáng)[18]，這同樣也提示復(fù)合植物提取物研發(fā)的必要性。

正交設(shè)計(jì)是一種開展多因素、多水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)的科學(xué)方法，可通過合理安排有代表性的組合、結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果分析，找出各因素的主次地位，獲得多因素最優(yōu)水平組合，已普遍用于中藥復(fù)方的研究。近年來，該方法也逐漸被用于中獸藥復(fù)方的研制[19]。本試驗(yàn)是涉及多項(xiàng)指標(biāo)評(píng)價(jià)的正交設(shè)計(jì)，通過對(duì)形成的16個(gè)復(fù)合提取物組合結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，獲得了分別以抑菌、抗炎、抗氧化為主的3個(gè)最優(yōu)組合，且發(fā)現(xiàn)每種組分的比例對(duì)復(fù)合提取物各功能具有顯著影響。提示中藥類復(fù)合植物提取物的有效性在很大程度上受到其各組分用量的影響，表明對(duì)復(fù)合植物提取物而言，進(jìn)行科學(xué)組方的必要性和重要意義。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果也表明，除了由于所用試驗(yàn)方法限制，導(dǎo)致3個(gè)最優(yōu)組合抑菌MIC值相等外，以抗炎為主的最優(yōu)組合Fai展現(xiàn)出最強(qiáng)抗炎活性。相似地，以抗氧化為主的最優(yōu)組合Fao展現(xiàn)出最強(qiáng)抗氧化活性。提示該正交試驗(yàn)結(jié)果具有較高準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。下一步將開展3個(gè)最優(yōu)組合在動(dòng)物體內(nèi)的應(yīng)用效果研究，以及揭示其生物活性成分，最終將應(yīng)用于斷奶仔豬替代飼用抗生素。

4 結(jié)論

首先通過抑菌、抗炎和抗氧化試驗(yàn)，從19種中藥類植物中遴選出5種作為復(fù)合提取物原料；進(jìn)一步通過L16(45)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化5種原料比例，獲得3個(gè)分別具有較強(qiáng)抑菌(Fab)、抗炎(Fai)和抗氧化(Fao)效果的多功能復(fù)合提取物組方，其原料厚樸、雞血藤、青蒿、桂枝和石榴皮在Fab、Fai和Fao中的比例依次為7∶13∶6∶9∶1、7∶13∶4∶1∶1和3∶13∶4∶1∶7。