一株野生多脂鱗傘的鑒定、人工栽培與營養(yǎng)成分分析

陳潤臣，王藝凝，劉瀟文，王紅艷，丁 強，王鴻磊

(中國農(nóng)業(yè)大學煙臺研究院，山東 煙臺 264670)

隨著生活水平的提高，人們對健康、綠色食品的要求越來越高。食用菌因其味道鮮美、營養(yǎng)豐富，且具有一定的保健和藥用功能[1-2]，越來越受人們的歡迎[3]，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織更將其納入“一葷一素加一菇”的合理膳食結(jié)構(gòu)中[4]。

鱗傘屬[Pholiota(Fr.)P.Kumm.]屬于擔子菌門(Basidiomycota)層菌綱(Hymenomycetes)傘菌目(Agaricales)球蓋菇科(Strophariaceae)，廣泛分布于世界各地，目前中國境內(nèi)記錄有63個種(包括亞種)[5]。鱗傘屬真菌是重要的食藥用菌資源，2019年我國小孢鱗傘(滑菇)的產(chǎn)量超過30萬t，成為我國13個食用菌主栽品種之一[6]。除小孢鱗傘外，我國可供食用的鱗傘屬真菌還有多脂鱗傘、黃鱗傘、金毛鱗傘、高地鱗傘等17個種[7-10]，其中，多脂鱗傘、黃鱗傘、粘鱗傘等9個種具有抗細菌、抗腫瘤、降血脂、提高機體免疫力等藥用價值[11-13]。然而目前我國除小孢鱗傘外，尚無大規(guī)模栽培其他鱗傘屬真菌的報道。

筆者于山東省棲霞市一蘋果園中采集到一個野生鱗傘屬真菌子實體，通過純種分離獲得了菌種。本文通過對該鱗傘屬真菌子實體、菌絲、孢子等的形態(tài)學觀察和分子生物學鑒定，確定了其分類地位，研究了其生物學性質(zhì)，通過栽培試驗獲得了子實體，并對子實體的營養(yǎng)成分進行了測定，以期為野生多脂鱗傘的人工栽培、液體發(fā)酵、活性物質(zhì)提取等開發(fā)利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 鱗傘屬真菌

于棲霞市蘋果園蘋果樹上采集到一個鱗傘屬真菌子實體，取菌蓋和菌柄連接處的菌絲組織接種于PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)獲得菌種，編號為EF-3。

1.1.2 培養(yǎng)基和栽培料

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水100 mL，pH值自然。

pH試驗培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基滅菌后，用過濾除菌的NaOH溶液和HCl溶液調(diào)pH值至4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。

碳源試驗培養(yǎng)基：土豆浸粉10 g，MgSO40.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，碳源分別為2%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米粉、紅糖、糖蜜、纖維素、麥芽糖和乳糖。

氮源試驗培養(yǎng)基：蔗糖20 g，MgSO40.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，氮源分別為1%的酵母浸粉、土豆浸粉、牛肉浸粉、蛋白胨、豆餅粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨和0.5%的氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀。

無機鹽試驗培養(yǎng)基：蔗糖20 g，豆餅粉10 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，無機鹽分別為0.1%的MgSO4、MnSO4、NaCl、CaSO4、FeSO4、K2HPO4、KH2PO4、Na2SO4、ZnSO4和K2SO4。

二級種培養(yǎng)料：麥粒90%、麩皮10%。新鮮麥粒煮至熟而不爛，加入麩皮拌勻，裝入菌種瓶，121 ℃滅菌150 min。

栽培料：玉米芯32%、木屑50%、麩皮15%、石灰1%、碳酸鈣1%、蔗糖1%。原料混勻后加水至含水量60%，放置2 h，裝袋，121 ℃滅菌150 min。

1.2 方法

1.2.1 鱗傘屬真菌EF-3的鑒定

子實體形態(tài)學觀察：參照文獻[14]的方法觀察子實體的形狀、顏色、鱗片、菌褶、菌柄等形態(tài)結(jié)構(gòu)特征并拍照。

菌絲、無性孢子觀察：將菌種接種于PDA培養(yǎng)基平板上，25 ℃培養(yǎng)。挑取菌絲體，用美蘭染色液制作水浸片，觀察菌絲、鎖狀聯(lián)合和無性孢子[15]。

孢子印制備：取新鮮的子實體，用刀片齊菌褶把菌柄切斷，把菌蓋扣在硫酸紙上，扣上玻璃罩，2～4 h后，擔孢子散落在紙上，即得孢子印[14]。

擔孢子觀察：取少量擔孢子，于奧林巴斯BX51光學顯微鏡下觀察擔孢子形態(tài)并拍攝照片。取凍干的子實體1個、干燥的擔孢子少許，用導電膠帶固定到樣品臺上，在表面噴鍍一層導電金，JSM-7610F掃描電子顯微鏡觀察擔孢子形態(tài)并拍攝掃描圖片[16-17]。

分子生物學鑒定：取子實體0.1 g，用CTAB法提取基因組DNA，使用真菌28S rDNA通用引物NL1(GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG)、NL4(GGTCCGTGTTTCAAGACGG)擴增28S rDNA的D1、D2區(qū)[18]。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，所得基因序列通過Blast程序與Genbank數(shù)據(jù)庫的序列比對，進行分子生物學鑒定。用MEGA 5.0進行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 生物學特性研究

最適生長溫度試驗：用內(nèi)徑8 mm打孔器打取菌落邊緣的菌絲塊，接種于PDA培養(yǎng)基平板表面，分別在5、10、15、20、25、30、35 ℃培養(yǎng)，定期測量菌落直徑，計算菌絲生長量。

最適pH值試驗：用內(nèi)徑8 mm打孔器打取菌落邊緣的菌絲塊，接種于pH試驗培養(yǎng)基平板表面，定期測量菌落直徑，計算菌絲生長量。

最佳碳源、氮源、無機鹽試驗：用內(nèi)徑8 mm打孔器打取菌落邊緣的菌絲塊，分別接種于碳源試驗培養(yǎng)基、氮源試驗培養(yǎng)基、無機鹽試驗培養(yǎng)基表面，25 ℃培養(yǎng)，定期測量菌落直徑，計算菌絲生長量。

1.2.3 栽培試驗

將菌種接種到PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)7 d得栽培母種。取4～5塊母種接種到麥粒培養(yǎng)基上，24 ℃培養(yǎng)得二級種。將二級種接種到栽培料上，24 ℃培養(yǎng)至產(chǎn)生黃色液滴，打開袋口去掉老菌皮，給予溫差刺激，維持相對濕度85%～95%，每天早晚噴水各1次，噴水后通風30 min直至現(xiàn)蕾，觀察出菇過程。

1.2.4 營養(yǎng)成分分析

多脂鱗傘EF-3子實體60 ℃干燥后，依據(jù)GB5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》、GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》、GB/T 15672—2009《食用菌中總糖含量的測定》、NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的測定》和GB5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》測定子實體中的蛋白質(zhì)、脂肪、總糖、多糖和游離氨基酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析與繪圖

利用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析和多重比較，利用Origin 9.1軟件進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱗傘屬真菌EF-3的鑒定

2.1.1 子實體形態(tài)學觀察

鱗傘屬真菌EF-3菌蓋初期扁半球形，后期平展、黃色，具叢毛狀三角形鱗片。鱗片同心圓排列，菌蓋中央顏色較深。鱗片與菌蓋結(jié)合處黃色至褐色，尖端白色至淺黃色(圖1-A)。菌蓋濕時黏，鱗片清洗易脫落。

菌柄淺黃色，中生或近中生，近等粗(圖1-B)，內(nèi)實，橫切面水漬狀斑點(圖1-C)。菌環(huán)絲膜狀，菌蓋邊緣殘留菌幕殘片(圖1-D)，菌環(huán)以下菌柄上有淡黃色鱗片，菌環(huán)以上光滑(圖1-B)。

菌肉淺黃色，菌肉與菌柄內(nèi)部顏色一致(圖1-E)。菌褶密，淺黃色，成熟后淺褐色，彎生、不等長、不分叉(圖1-B)。

A，菌蓋正面；B，菌蓋背面；C，菌柄橫切；D，內(nèi)菌幕和菌褶；E，子實體縱切。

一個擔子上4個擔孢子(圖2-A)，擔孢子腎形，頂部有孔口，向內(nèi)彎曲(圖2-B)，大小(5.5～7.5)μm×(3.5～5.0)μm，長寬比約1.2～2.0(圖2-C)。孢子印褐色(圖2-D)。

圖2 擔孢子和孢子印

2.1.2 菌落和菌絲形態(tài)觀察

鱗傘屬真菌EF-3菌落呈規(guī)整的圓形，蔓延生長，棉絮狀，質(zhì)地疏松，菌落表面有同心輪紋。菌落無色至淡黃色，中心顏色略深于四周，不產(chǎn)水溶性色素(圖3-A)。菌絲多分枝，直徑1.5～3.5 μm，具鎖狀聯(lián)合(圖3-B)。平板培養(yǎng)3 d左右產(chǎn)無性孢子，孢子大小(7.5～13.75)μm×(2.25～4.25)μm(圖3-C)。

2.1.3 分子生物學鑒定

利用CTAB法提取鱗傘屬真菌EF-3基因組DNA，用引物NL1、NL4擴增28S rDNA的D1、D2區(qū)。PCR產(chǎn)物送生工生物(上海)股份有限公司進行序列測定。Blast序列相似性比對結(jié)果顯示：鱗傘屬真菌EF-3的28S rDNA的D1、D2區(qū)序列與多脂鱗傘(Pholiotaadiposa)的相關序列相似率均高達98%以上，結(jié)合形態(tài)學指標鑒定其為多脂鱗傘。多脂鱗傘EF-3與鱗傘屬其他種的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示。

2.2 生物學特性

2.2.1 最適生長溫度

如圖5所示，多脂鱗傘EF-3菌絲在5 ℃生長極其緩慢，隨著溫度的升高，其菌絲生長加快，當培養(yǎng)溫度提高到25 ℃時菌絲生長最快。培養(yǎng)溫度超過25 ℃時菌絲生長速度急劇下降，培養(yǎng)溫度提高至35 ℃時菌絲幾乎不生長。

柱上無相同字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2.2 最適生長pH值

如圖6所示，多脂鱗傘EF-3菌絲在pH值4.5～11.0均可生長，其最適pH值為5.0，當pH值超過5.0時，菌絲生長速度緩慢降低，至pH值為11時菌絲仍能保持較快的生長速度。

圖6 多脂鱗傘EF-3在不同pH值下的菌絲生長量

2.2.3 最適碳源

碳源是多脂鱗傘最重要的營養(yǎng)物質(zhì)，可為多脂鱗傘的生長提供碳元素和能量。多脂鱗傘EF-3能利用的碳源譜較廣泛(圖7)，無論是大分子的纖維素、淀粉，還是小分子的葡萄糖均能被菌絲吸收。但多脂鱗傘菌絲在不同碳源培養(yǎng)基上生長速度不同，其中，在乳糖為碳源的培養(yǎng)基上生長最慢，在以蔗糖、紅糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長最快。

A，葡萄糖; B，蔗糖; C，淀粉; D，玉米粉; E，紅糖; F，糖蜜; G，纖維素; H，麥芽糖; I，乳糖。

2.2.4 最適氮源

氮是構(gòu)成蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的重要元素，也是維生素、氨基酸等活性物質(zhì)合成的基礎。從圖8可以看出，多脂鱗傘EF-3可利用的氮源非常廣泛，不管是無機氮源還是有機氮源都能很好地利用。總體上看，多脂鱗傘EF-3在有機氮源培養(yǎng)基上的生長速度明顯高于無機氮源培養(yǎng)基。菌絲在不同有機氮源培養(yǎng)基上生長速度也有明顯差異，其中，以豆餅粉為氮源的培養(yǎng)基最利于菌絲生長。

A，氯化銨；B，硫酸銨；C，硝酸銨；D，硝酸鉀；E，酵母浸粉；F，土豆浸粉；G，牛肉浸粉；H，蛋白胨；I，豆餅粉；J，胰蛋白胨；K，大豆蛋白胨。

2.2.5 最適無機鹽

結(jié)果(圖9)表明，培養(yǎng)基內(nèi)添加不同無機鹽對多脂鱗傘EF-3菌絲生長有不同的作用。硫酸錳對菌絲生長具有明顯促進作用，而培養(yǎng)基內(nèi)添加0.1%硫酸鉀、硫酸鈉等無機鹽后，多脂鱗傘EF-3菌絲生長明顯受到抑制。硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鈣等無機鹽的加入對多脂鱗傘EF-3菌絲的生長沒有明顯作用。

圖9 多脂鱗傘EF-3在不同無機鹽下的菌絲生長量

2.3 多脂鱗傘EF-3栽培實驗

將多脂鱗傘EF-3母種接種到麥粒二級種培養(yǎng)基中，24 ℃培養(yǎng)46 d長滿瓶。將麥粒種接種到栽培料菌袋中，24 ℃培養(yǎng)約27 d長滿菌袋。繼續(xù)培養(yǎng)26 d至有黃色液滴產(chǎn)生，說明菌絲已成熟。打開袋口，去掉老菌皮，給予不低于10 ℃的溫差刺激，7 d后出現(xiàn)米粒大小的菇蕾。菇蕾初期小米粒狀，2～3 d后頂部開始膨大形成帶鱗片的半球形菌蓋。隨著子實體的逐漸長大，菌蓋展開，菌蓋與菌柄接觸部位的內(nèi)菌幕被一層層撕裂，殘留在菌蓋和菌柄上形成鱗片。當菌蓋剛剛完全展開時，即可采收，從現(xiàn)蕾到采收約10～12 d(圖10)。

A，現(xiàn)蕾；B，現(xiàn)蕾3 d；C，現(xiàn)蕾5 d；D，現(xiàn)蕾8 d；E，現(xiàn)蕾10 d；F，現(xiàn)蕾12 d。

2.4 營養(yǎng)成分

多脂鱗傘EF-3子實體營養(yǎng)成分如圖11所示。子實體蛋白質(zhì)含量為19.94%，與大宗食用菌品種香菇、平菇、金針菇等相當；脂肪含量只有2.32%，屬于高蛋白低脂肪的健康食品。多糖和游離氨基酸含量相對較低。游離氨基酸以谷氨酸含量最高，占游離氨基酸總量的31.3%。

Asp，天冬氨酸；Glu，谷氨酸；Ser，絲氨酸；Thr，蘇氨酸；Ala，丙氨酸；Tyr，酪氨酸；Ile，異亮氨酸；Phe，苯丙氨酸。

3 結(jié)論與討論

我國是食用菌生產(chǎn)第一大國，2019年我國食用菌總產(chǎn)量達到3 933.87萬t[6]，其中，香菇、黑木耳、平菇等7個主要品種產(chǎn)量占比高達85%，說明我國食用菌產(chǎn)業(yè)品種結(jié)構(gòu)嚴重不平衡，如何優(yōu)化食用菌產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)是食用菌科研人員和從業(yè)人員急需解決的問題。野生食用菌味道鮮美，營養(yǎng)豐富，具有一定的滋補和食療保健價值，深受世界各地人民的喜愛，越來越多地出現(xiàn)在人們的餐桌上[19-20]。但是我國野生食用菌主要的獲取手段是野外采集，隨著人們對野生菌需求量的上升，僅靠野外采集已經(jīng)不能滿足需求，而過度采集不但嚴重影響野生食用菌的可持續(xù)發(fā)展，而且會破壞環(huán)境[21]，故開展野生食用菌的人工馴化工作勢在必行[22]。

鱗傘屬是球蓋菇科中一個重要的屬，此屬的真菌除少數(shù)對人體有毒外，都是營養(yǎng)豐富、極具開發(fā)應用潛力的食藥用真菌[23]。目前鱗傘屬真菌中只有小孢鱗傘進行了大規(guī)模的人工栽培，尚有白鱗傘[24]、翹鱗傘[25]、黃鱗傘等[13]處于人工馴化階段。

本研究采集并人工栽培了一株野生鱗傘屬真菌，其子實體初期扁半球形，后期平展，黃色，具叢毛狀三角形鱗片，鱗片同心圓排列；菌柄淺黃色，中生或近中生，內(nèi)實，橫切面水漬狀斑點；菌環(huán)絲膜狀，菌蓋邊緣殘留菌幕殘片，菌環(huán)以下菌柄上有淡黃色鱗片；菌肉淺黃色，菌肉與菌柄內(nèi)部顏色一致；菌褶密，淺黃色，成熟后淺褐色，彎生、不等長、不分叉；擔孢子腎形，頂部有孔口，孢子印褐色；菌落無色至淡黃色，菌絲多分枝，具鎖狀聯(lián)合，產(chǎn)無性孢子。形態(tài)學和分子生物學鑒定確定其分類學地位為多脂鱗傘，其最適生長溫度為25 ℃，最適pH值為5.0，最適碳源、氮源和無機鹽分別是蔗糖、豆餅粉和MnSO4。麥粒種46 d滿瓶，菌絲長滿栽培袋需27 d，自接種至采收約需70 d。子實體蛋白質(zhì)含量為19.94%，多糖含量為5.14%，脂肪含量為2.32%，游離氨基酸含量為2.84%。以上研究結(jié)果對野生多脂鱗傘的人工栽培具有一定的指導意義。該菌株屬中低溫品種，適于北方地區(qū)春秋兩季大棚栽培或工廠化栽培，其示范推廣有利于我國食用菌品種結(jié)構(gòu)的優(yōu)化。

食用菌母種培養(yǎng)階段會形成粉孢子、分生孢子、節(jié)孢子、厚垣孢子等無性孢子，有的無性孢子萌發(fā)會形成不結(jié)實或結(jié)實能力差的菌絲，影響食用菌產(chǎn)量，如金針菇的粉孢子[26]；有的無性孢子的形成與產(chǎn)量和品質(zhì)無直接關系，但可以緩解菌種退化，如草菇的厚垣孢子[27-28]。多脂鱗傘EF-3菌株在母種培養(yǎng)時也會產(chǎn)生大量的無性孢子，其無性孢子的類型、產(chǎn)生條件、萌發(fā)后菌絲的結(jié)實能力、是否會造成菌種退化等問題還需要進一步研究。