外源鈣浸種對小麥防御酶和麥二叉蚜體內解毒酶活性的影響

王 駿，吳小保，宋 佳，鄧倩倩，曾 廣，任明見，葉 茂，*

(1.貴州大學 昆蟲研究所，貴州 貴陽 550025；2.貴州省山地農業病蟲害重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.國家小麥改良中心貴州分中心，貴州 貴陽 550025)

小麥(TriticumaestivumL.)是重要的糧食作物[1-2]。麥二叉蚜[Schizaphisgraminum(Rondani)]及其傳播的大麥黃矮病毒(BYDV)嚴重影響小麥品質和產量的提高，但長期大量使用農藥會導致麥二叉蚜抗藥性持續增強，使控蚜工作變得更加艱巨[3]。為了更好地防治麥二叉蚜，亟須尋找有效且環境友好的新方法。

植物能識別植食性昆蟲為害，并系統性地在形態、生理、生化等多個層面做出特異性的防御反應，如植物腺毛、葉面蠟質、角質層、細胞壁等均會阻礙蚜蟲取食[4]。此外，植物體內的保護酶、防御酶、蛋白酶抑制劑等在防御過程中也發揮著十分關鍵的作用[5]。防御反應按時間維度一般可分為組成型和誘導型防御2類[6]。其中，組成型防御是預先形成的；而誘導防御反應則表現為一系列活性氧信號物質的合成，及其誘導下游植物激素介導的防御反應[7]。在植物進行防御的過程中，過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和β-1，3葡聚糖酶(β-1，3-GA)等在植物的脅迫應答過程中扮演著重要的角色[8-9]。研究發現，抗蚜品種的小麥遭受禾谷縊管蚜[Rhopalosiphumpadi(Linnaeus)]取食后，葉片中的超氧化物歧化酶(SOD)、POD和PPO活性顯著高于感蚜品種[10]，PAL、酪氨酸解氨酶(TAL)、POD、Ca2+-ATP酶(Ca2+-ATPase)、Mg2+-ATP酶(Mg2+-ATPase)的活性亦顯著高于感蚜品種[11]；抗蚜品系的小麥在遭蚜蟲取食后，葉片的PAL、POD、幾丁質酶活性急劇上升，而上述酶的活性在感蚜品系小麥的葉片中雖然也有上升，但上升緩慢[12]。這些研究結果均顯示，防御酶活性的提高是小麥抗蚜的重要因素[13]。

面對植物的防御體系，植食性昆蟲演化出多種反防御機制以維持種群發展，包括行為防御、生理防御和生物化學防御機制[14]。研究發現，昆蟲能利用自身的解毒酶系統對攝入體內的有毒物質進行解毒[15]。昆蟲的解毒酶系主要存在于昆蟲的中腸、線粒體、脂肪體和高爾基體中，可將親脂性的物質分解轉化為親水性的物質，從而加速溶解和排泄，其中，谷胱甘肽巰基轉移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarE)和細胞色素P450(CYP450)是昆蟲體內重要的解毒酶[14，16]。研究發現，麥長管蚜[Sitobionavenae(Fabricius)]取食生物堿含量高的抗蚜小麥品種后，其體內CarE活性顯著升高[17]；麥長管蚜取食經不同濃度氧肟酸處理的小麥植株后，其體內過氧化氫酶(CAT)、CYP450和GSTs活性均隨著氧肟酸濃度的增加而顯著增加[18]。以上研究表明，蚜蟲在與小麥互作的過程中可通過提高防御酶活性的方式來減少對方帶來的傷害。

利用外源物誘導來提高植物抗性是目前病蟲害綜合防治領域的研究熱點[19-20]。近年來，大量的研究發現，昆蟲口腔分泌物[21]、自身揮發的氣體物質，以及取食誘導的植物揮發物[22-23]均可顯著誘導植物的抗蟲性，一些金屬元素(如銅、鉀等)[24-26]和非金屬元素(如硅)[27-28]也可以顯著誘導植物的抗蟲性。鈣元素是植物生長發育必需的營養元素，外源鈣處理可以顯著提高植物對非生物和生物逆境脅迫的抗性[29-30]；但關于鈣在生物逆境脅迫方面的研究主要集中于植物病害領域，缺乏對蟲害的研究。而且，在本研究檢索范圍內，關于外源鈣介導下植物與害蟲的互作關系也未見報道。為此，本文以紫粒小麥貴紫1號和麥二叉蚜為研究對象，采用氯化鈣(CaCl2)浸種的方式對小麥進行外源鈣處理，比較經外源鈣處理后的小麥植株遭受麥二叉蚜取食后防御酶活性的變化，以及麥二叉蚜取食經外源鈣處理的小麥植株后其體內解毒酶活性的變化，探討外源鈣介導下小麥和蚜蟲間的相互作用關系，以期為有效防控蚜蟲提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 供試植物與昆蟲

小麥品種貴紫1號由貴州大學農學院小麥研究中心提供。

麥二叉蚜采自國家小麥改良中心貴州分中心，在人工氣候箱[溫度(25±1)℃，相對濕度(60±10)%，光/暗周期14 h/10 h]內用貴紫1號麥苗飼養30代以上供試。

1.2 實驗方法

CaCl2浸種(T)處理：挑選健康飽滿的小麥種子，經10%(體積分數)過氧化氫滅菌10 min，蒸餾水沖洗3次后，用20 mmol·L-1CaCl2浸泡48 h，對照(CK)用水進行浸種處理。待各處理種子露白后播種于塑料杯中，并置于人工氣候箱(培養條件同上)中培養，待小麥長至兩葉一心時備用。

蚜蟲取食處理：在各處理小麥植株第2片葉的正面接入20頭3齡麥二叉蚜取食，用透明塑料筒罩住塑料杯(頂端帶有紗網)防止蚜蟲逃逸。分別在麥二叉蚜取食0、24、48、72 h時收集不同處理的小麥葉片，檢測葉片防御酶活性。收集取食各處理植株葉片0、24、48、72 h的蚜蟲，檢測其體內解毒酶活性。各項指標重復測定3次。

1.3 測定指標

1.3.1 POD、PPO活性檢測方法

將待測小麥葉片(0.1 g)放置于2.0 mL離心管中，加入1 mL 0.05 mol·L-1磷酸緩沖液[內含5%(質量分數)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，pH值為7.2]，在冷凍研磨機上研磨。研磨完成后，渦旋振蕩10 s，于冷凍離心機中4 ℃條件下12 000×g離心15 min，取上清液(酶液)用于酶活性檢測。POD活性參照袁慶華等[31]的方法，采用愈創木酚法測定；PPO活性參照吳文華等[32]的方法，采用鄰苯二酚法測定。酶活性以單位時間單位質量蛋白所含有的酶活單位(U·min-1·mg-1)表示。

1.3.2 PAL、β-1，3-GA、GSTs、CarE和CYP450活性檢測方法

分別按照苯丙氨酸解氨酶活性檢測試劑盒、β-1，3葡聚糖檢測試劑盒、谷胱甘肽巰基轉移酶活性檢測試劑盒和羧酸酯酶活性檢測試劑盒說明書檢測PAL、β-1，3-GA、GSTs和CarE的活性，以上試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，酶活單位為U·mg-1。按照昆蟲細胞色素P450測試盒說明書檢測CYP450活性，該試劑盒購自南京建成生物科技有限公司，酶活單位為ng·mg-1。

1.3.3 蛋白含量檢測

采用Bradford[33]方法檢測蛋白含量，使用牛血清蛋白作為標準蛋白。

1.4 數據處理與分析

利用Microsoft Excel 2016軟件進行數據整理，在SPSS 21.0軟件中進行統計分析。用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗同一處理不同時間段酶活性間的差異顯著性(顯著性水平α=0.05)，用Student’st-test檢驗同一時間不同處理間的差異顯著性(顯著性水平α=0.05)。

2 結果與分析

2.1 對小麥葉片防御酶活性的影響

麥二叉蚜取食和氯化鈣浸種處理均對小麥葉片的防御酶活性有顯著影響，且防御酶活性的變化還與麥二叉蚜的取食時間有關(圖1～4)。

柱上無相同字母的表示同一處理不同時間酶活性差異顯著(P<0.05)，標“*”的表示同一取食時間不同處理間酶活性差異顯著(P<0.05)。下同。

CK處理下，小麥遭麥二叉蚜取食24、48、72 h時，葉片POD和β-1，3-GA活性均顯著升高，分別在取食48 h和72 h時活性最高；葉片PPO活性在72 h時與24、48 h時相比顯著降低，但24、48、72 h時的PPO活性與取食前(0 h)均無顯著差異；葉片PAL活性隨著取食時間的增加呈先降低后上升的趨勢，在24 h時最低，在72 h時最高。

T處理下，小麥遭麥二叉蚜取食24、48、72 h時，葉片POD和β-1，3-GA活性均顯著升高，分別在48 h和72 h時活性最高；麥二叉蚜取食48 h時，葉片的PPO活性顯著高于取食前，但其他時間段的葉片PPO活性無顯著差異；葉片的PAL活性在24 h時顯著低于取食前，其他時間段的葉片PAL活性無顯著差異。

未遭麥二叉蚜取食時，T處理小麥葉片的PAL和β-1，3-GA活性分別比CK顯著升高78.11%和18.92%。遭麥二叉蚜取食24、48、72 h，T處理小麥葉片的POD、PAL、β-1，3-GA活性分別比相同取食時間下的CK處理顯著升高92.01%、66.11%、44.64%(24 h)，10.12%、12.60%、12.31%(48 h)和178.32%、163.05%、100.56%(72 h)；遭麥二叉蚜取食48、72 h時，T處理小麥葉片的PPO活性分別比相同取食時間下的CK處理顯著升高21.66%、13.66%。

圖2 不同處理對小麥葉片多酚氧化酶(PPO)活性的影響

圖3 不同處理對小麥葉片苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響

圖4 不同處理對小麥葉片β-1，3葡聚糖酶(β-1，3-GA)活性的影響

2.2 對麥二叉蚜體內解毒酶活性的影響

麥二叉蚜未取食小麥時(0 h)，CK和T處理下其體內解毒酶GSTs、CarE和CYP450的活性均無顯著差異；取食后，CK和T處理下麥二叉蚜體內3種解毒酶的活性發生顯著變化(圖5～7)。

圖5 不同處理對麥二叉蚜體內谷胱甘肽巰基轉移酶(GSTs)活性的影響

CK處理下，麥二叉蚜取食小麥后，其體內GSTs活性隨取食時間的增加呈降低趨勢，在48 h和72 h時顯著低于取食前；CarE活性在不同取食時間間無顯著變化；CYP450活性僅在48 h時顯著高于取食前。T處理下，麥二叉蚜取食小麥后，其體內GSTs活性在不同取食時間間無顯著變化；CarE活性隨取食時間的增加呈逐漸上升的趨勢，在48 h和72 h時顯著高于取食前；CYP450活性在24、48、72 h時均顯著高于取食前。

圖6 不同處理對麥二叉蚜體內羧酸酯酶(CarE)活性的影響

圖7 不同處理對麥二叉蚜體內細胞色素P450(CYP450)活性的影響

與取食CK處理的相比，麥二叉蚜取食T處理的小麥后，其體內GSTs活性在48 h和72 h時分別顯著升高259.60%和227.00%，CarE活性在24、48、72 h時分別顯著升高32.81%、36.06%和48.54%，CYP450活性在24 h和72 h時分別顯著升高7.95%和23.40%。

3 結論與討論

盡管植物會啟動一系列的誘導防御系統來應對蚜蟲的為害，但蚜蟲仍然能“攻破”甚至可以“操控”寄主植物的防御系統，并成功地在寄主植物上生存和繁殖[34-35]。蚜蟲作為農業上重要的刺吸式口器昆蟲，其獨特的取食方式和特化的口針決定了其與寄主植株互作的復雜性，因而研究蚜蟲的反防御機理有助于新型抗蚜植株的篩選和培育。

POD、PPO、PAL和β-1，3-GA是植物上重要的防御酶，在植物應對害蟲脅迫的應答過程中扮演著重要的角色[8-9]。POD是維持植物體自由基平衡的關鍵防御酶，可參與防御物質中酚類和醌類等化合物的合成，抑制昆蟲的生長[8，36]。PPO是催化植物體酚類物質生成木質素和醌類化合物的關鍵酶，可減少害蟲對植物營養的獲取[37-38]。PAL是植物體內次生代謝反應的關鍵酶和限速酶，在植物損傷信號傳導和防御蟲害中發揮著重要作用[8，39]。β-1，3-GA是一種主要分布于寄主細胞質膜和細胞壁的重要水解酶，可以水解病原菌的細胞膜，減輕植物病害[14，40]。寄主植物的防御酶活性與其抗蟲能力密切相關，通常，抗性越高的品種，其防御酶的活性越強[40-41]。張廷偉等[10]和Xu等[11]研究發現，禾谷縊管蚜取食為害后，抗蚜品種葉片中的SOD、TAL、POD、PPO和PAL活性均顯著高于感蚜品種。本試驗結果表明，CK處理下，小麥植株遭麥二叉蚜取食后，其葉片POD、PAL和β-1，3-GA活性均不同程度升高，說明這3種防御酶在小麥植株抵御麥二叉蚜取食為害的過程中發揮著重要的作用。經外源鈣浸種處理的小麥植株，其葉片PAL和β-1，3-GA活性在遭麥二叉蚜取食前顯著高于CK處理的植株，遭受蚜蟲取食后，其活性也更強。蚜蟲取食前，T處理小麥葉片的POD和PPO活性與CK相比并無顯著差異；但當蚜蟲取食后，這2種酶的活性也顯著高于CK。這些結果表明，經外源鈣浸種處理的小麥，其防御酶活性更強，這有利于提高小麥對蚜蟲的抗性。相似的現象在其他學者的研究中也有報道：王祎等[25]研究發現，鉀可以顯著提高小麥脂氧合酶(LOX)、POD、PAL和POD活性，降低麥長管蚜的種群數量；Zeng等[7]也發現，葉片噴施氯化鈣可以顯著增強PAL和β-1，3-GA活性，提高菜豆(PhaseolusvulgarisLinn.)植株對西花薊馬[Frankliniellaoccidentalis(Pergande)]的抗性。

解毒酶是昆蟲體內主要的防御酶，主要包括GSTs、CarE和CYP450[14，16]。GSTs是在昆蟲代謝過程中具有多種生理功能的一類活性蛋白質，不僅參與多種植物次生物質的代謝，還參與殺蟲劑的代謝[42-43]。CarE能有效催化酯類和酰胺類化合物的水解，與多種藥物、環境毒物、致癌物的解毒和代謝有關[44]。CYP450介導的多功能氧化酶是昆蟲體內參與各類殺蟲劑，以及其他外源性和內源性化合物代謝的主要解毒酶系[45]。本研究表明，麥二叉蚜取食CK處理的小麥植株24、48、72 h后，其體內GSTs活性逐漸降低，CarE活性無顯著變化，CYP450活性只在取食48 h時顯著高于取食前；而取食T處理的小麥植株后，麥二叉蚜體內GSTs、CarE和CYP450活性在不同取食時間顯著高于取食CK處理小麥植株的蚜蟲，結合小麥葉片POD、PPO、PAL和β-1，3-GA酶活性的變化情況，推測是麥二叉蚜為了應對小麥植株升高的抗性，其體內GSTs、CarE和CYP450活性也相應增強。Lan等[46]對取食抗蚜品種和感蚜品種的麥長管蚜進行轉錄組比較分析，發現取食抗性小麥品種后，麥長管蚜體內18個與解毒代謝的基因顯著上調；牟少飛等[47]也發現，煙粉虱[Bemisiatabaci(Gennadius)]取食含有低劑量槲皮素的飼料后，其體內CarE和GSTs活性顯著升高；董均鋒等[48]發現，煙青蟲(Heliothisassulta)取食含有煙堿和辣椒素的人工飼料后，體內GSTs活性顯著升高。以上研究結果均與本研究結果一致，說明GSTs、CarE和CYP450在昆蟲解毒或適應寄主防御系統的過程中發揮著重要的作用。

綜上，本研究發現，外源鈣對小麥植株中的防御酶活性有明顯誘導作用。麥二叉蚜取食經外源鈣處理的小麥植株后，其體內解毒酶的活性也相應升高，以應對小麥植株增強的抗性。然而，外源鈣介導下小麥與蚜蟲的互作關系不只局限于二者體內酶活性的變化，關于取食和選擇行為等方面的互作機理等還有待繼續研究。