不同品種芹菜可食部分的降壓活性成分及其體外血管緊張素轉換酶抑制活性

馬子甲，張凱杰，陸勝民，，*，徐志豪，鄭美瑜，劉 哲，王 璐，楊 穎

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華321000；2.江蘇楷益智能科技有限公司，江蘇 無錫 214100；3.浙江省農業科學院 食品科學研究所/浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室，浙江 杭州 310021；4.浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

芹菜(ApiumgraveolensL.)別名芹、早芹、香芹、蒲芹、藥芹菜、野芫荽，為傘形科芹屬中一、二年生草本植物[1]，在我國栽培歷史悠久，分布很廣，全國大部分地區均有栽培。其含有多種活性物質[2-4]，主要包括類黃酮物質及其苷類化合物(芹菜素、木犀草素)、苯酞類化合物等[5-6]。芹菜具有很好的藥用功能[7-8]，其所含的黃酮類物質，包括黃酮及其衍生物多以苷態存在，具有調節毛細血管的脆性和通透性、降血壓、降血脂、清除自由基抗氧化、抗凝血和抗血栓形成、抵抗心血管疾病等功效[9-10]。芹菜的根、莖、葉、籽具有降血壓的作用，在現代藥理學研究中也得到了進一步證實[11-12]。目前，芹菜中降血壓活性物質研究較多的是黃酮化合物和多酚類化合物，其中，具有降壓作用的黃酮類物質主要為槲皮素、芹菜素和木犀草素[13]，其降壓機制可能與減少氧化應激、干擾腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)，以及以內皮依賴性和非依賴性方式改善血管內皮功能等有關。芹菜中的多酚類化合物主要有咖啡酸、綠原酸、黃烷醇及其衍生物[14]，多酚類化合物通過提高體內抗氧化酶活性、減少細胞黏附分子表達等機制預防心血管疾病發生[15]。

血管緊張素轉換酶(angiotensin coverting enzyme，ACE)活性在調節動脈血壓中起關鍵作用[16]，ACE通過催化血管緊張素Ⅰ轉化為有效的血管收縮劑血管緊張素Ⅱ而達到升高血壓的作用。黃酮類化合物是一種很好的功能性降壓物質，對血管緊張素轉換酶具有抑制作用[17]，木犀草素、槲皮素、蘆丁、山奈酚和芹菜素在體外有很好的ACE抑制活性[18]。

本文對19個品種芹菜葉水提物的體外ACE抑制活性、總酚和總黃酮含量進行測定，篩選出ACE抑制活性較強和活性成分含量較高的8種芹菜，測定其葉和莖水提物的ACE半抑制濃度(IC50)，以選出體外ACE抑制活性最高或活性成分含量高的芹菜品種，為芹菜的食用和降血壓活性成分研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗芹菜品種共計19個(表1)，所用的芹菜籽由國家農作物種質資源共享服務平臺-蔬菜種質資源子平臺、國家蔬菜種質資源中期庫提供，并且由浙江省農業科學院蔬菜研究所統一栽培，栽培基地位于桐鄉市鳳鳴衛杰家庭農場。

1.2 試劑與儀器

血管緊張素轉化酶(酶活性為2.0 U·mg-1)，Sigma公司；蘆丁(分析純，97%)、沒食子酸(分析純，98.5%)、卡托普利、馬尿酰-組氨酸-亮氨酸(分析純，98%)，上海源葉生物科技有限公司；福林酚，上海麥克林生化科技有限公司；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、碳酸鈉、硼酸、四硼酸鈉、氯化鈉均為分析純。

BS200S-WE1電子天平，余姚金諾電子天平儀器有限公司；RE-52A旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；LXJ-HB飛鴿低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；SHZ-D(III)型循環水真空泵，杭州明遠儀器有限公司；UV-1800紫外/可見分光光度儀，日本島津公司；DK-8B型電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司；SCIENTZ-18N型冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 總酚標準曲線制作

采用福林酚比色法[15]，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL 100 mg·L-1沒食子酸標準溶液于25 mL容量瓶中，加入2.5 mL Folin Ciocalteu顯色劑，搖勻；再加入5 mL 5%碳酸鈉溶液，加水定容，在40 ℃下避光放置40 min，在750 nm處測定其吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標，其吸光度為縱坐標，制作總酚標準曲線。

1.3.2 總黃酮標準曲線的制作

采用硝酸鋁絡合分光光度法[19]，稱取無水蘆丁標準品適量，加無水乙醇制成200 mg·L-1標準品溶液。吸取該溶液0、1、2、3、4、5、6 mL分別置于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加4% NaOH溶液10 mL，搖勻，加水至刻度，放置15 min后在509 nm的波長處測定其吸光度。以無水蘆丁濃度為橫坐標，其吸光度為縱坐標，制作總黃酮標準曲線。

1.3.3 芹菜ACE抑制活性的測定

參考Cushman等[20]的方法并進行改進，具體操作步驟為：取5 mmol·L-1的馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)溶液200 μL加入4組試管中，分別標記為A、B、C、D；A、B兩組加入pH值8.3的硼酸緩沖液30 μL，C、D兩組加入等體積的抑制劑(芹菜提取物)，混勻后在37 ℃保溫5 min；然后A、C兩組加入0.06 U·mL-1ACE溶液100 μL，B、D兩組加入等體積pH值8.3的硼酸緩沖液，混勻后在37 ℃反應30 min；反應結束后4組試管均加入250 μL 1 mol·L-1HCl終止反應。然后均加入1 500 μL乙酸乙酯進行萃取，4 000×g離心10 min后取1 mL上層乙酸乙酯萃取液于另一試管，沸水浴15 min蒸發去除乙酸乙酯；再加入3 mL蒸餾水于試管中溶解殘留物，在228 nm處測定吸光值。5 mmol·L-1的HHL溶液和0.05 U·mL-1的ACE溶液均由0.1 mol·L-1含有0.3 mol·L-1NaCl的磷酸緩沖液(pH值8.3)配制。ACE抑制活性(I，%)計算公式如下：

(1)

式(1)中：DA，含ACE、不含抑制劑時的吸光度；DB，不含ACE和抑制劑時的吸光度；DC，同時含有ACE和抑制劑時的吸光度；DD，不含ACE但含抑制劑時的吸光度。

1.3.4乙醇濃度對芹菜葉體外ACE抑制活性的影響

在相同提取條件[料液比1∶30(g·mL-1)、提取時間2 h、提取溫度60 ℃]下，用不同濃度(0、50%、60%、70%、80%)的乙醇溶液(用蒸餾水配制)提取四季慢芹菜葉凍干粉，4 000×g離心10 min后取上清，用冷凍干燥機凍干提取液后用蒸餾水溶解稀釋到2 mg·mL-1，按照1.3.3節的方法，測定其體外ACE抑制活性。

1.3.5 ACE抑制活性與活性成分測定

將凍干的不同品種芹菜葉粉碎，稱取0.50 g芹菜葉粉，以蒸餾水為提取劑，在相同條件[料液比1∶30(g·mL-1)，提取溫度60 ℃，提取時間2 h]下提取，4 000×g離心10 min后取上清，按照1.3.4節方法進行體外ACE抑制活性測定，按照1.3.1節方法測定樣品總酚含量，按照1.3.2節的檢測方法測定樣品總黃酮含量。

1.3.6 體外ACE IC50測定

稱取初步篩選出來的8種芹菜品種的葉和莖凍干粉各1.00 g，以蒸餾水為提取劑，在相同條件[料液比1∶30(g·mL-1)，提取溫度60 ℃，提取時間2 h]下提取，4 000×g離心10 min后取上清液凍干即為芹菜提取物凍干粉。稱取上述芹菜提取物凍干粉0.10 g，加蒸餾水稀釋成5個濃度梯度，分別為0.781 25、1.562 5、3.125、6.25和12.5 mg·mL-1，測定其體外ACE抑制活性。用Origin 2021軟件擬合ACE抑制活性曲線，計算芹菜體外ACE半抑制濃度(IC50)。

1.4 數據處理

每組實驗平行進行3次，根據實驗結果計算其平均值和標準差，使用統計軟件IBM SPSS Statistics 25對實驗數據進行差異顯著性分析，然后利用IBM SPSS Statistics 25軟件對測定的指標進行皮爾遜相關性分析。運用Origin 2021軟件對相關系數進行熱圖繪制，篩選出體外ACE抑制活性最高的芹菜品種。

2 結果與分析

2.1 乙醇濃度對芹菜葉體外ACE抑制活性的影響

由圖1可知：在不添加乙醇即提取液為水時，芹菜葉提取物的ACE抑制活性最高，為91.81%；乙醇濃度為80%時，提取物的ACE抑制活性為負，表示其對ACE沒有抑制活性，這可能與其凍干粉用水復溶時不完全溶解有關。

柱上無相同小寫字母表示試驗組間差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 體外ACE抑制活性與活性成分含量

由表1可知，19個品種芹菜葉水提物都有體外ACE抑制活性，集中在80%～100%，其中，涇川芹菜葉的體外ACE抑制活性最低，為(79.79±1.02)%，而紫芹葉的體外ACE抑制活性最高，達到了(105.13±1.41)%，這可能是由于芹菜葉提取物中降壓活性物質濃度較高造成的。蘆丁濃度為0～48 mg·L-1時與吸光度呈良好線性關系，回歸方程為y=0.011 1x-0.020 5，R2=0.995 5。根據標準曲線計算得到19個品種芹菜葉水提物的總黃酮含量，總黃酮含量集中在200～250 mg·L-1，中位數為234.7 mg·L-1；其中，白芹葉水提物的總黃酮含量最低，為(168.38±0.88)mg·L-1，白梗芹菜葉水提物的總黃酮含量最高，為(261.71±2.43)mg·L-1。沒食子酸濃度為0～8 mg·L-1時與吸光度呈良好線性關系，回歸方程為y=0.100 5x+0.016，R2=0.999 5；根據總酚標準曲線計算得到19個品種芹菜葉水提物中總酚含量集中在130～150 mg·L-1，中位數為140 mg·L-1，其中，空桿綠芹葉水提物的總酚含量最低，為(119.40±1.29)mg·L-1，紫芹葉水提物的總酚含量最高，為(182.49±3.65)mg·L-1。

表1 不同品種芹菜葉體外ACE抑制活性及其總黃酮、總酚含量

2.3 體外ACE抑制活性與總酚、總黃酮含量熱圖分析和相關性分析

從圖2可以看出，芹菜葉水提物體外ACE抑制活性較好的品種按活性高低依次為紫芹、細葉芹菜、青梗芹菜、青藥芹；總酚含量較高的品種依次為紫芹、四季慢芹菜、細葉芹菜、Ts123.010、青梗芹菜；黃酮含量較高的品種依次為白梗芹菜、青梗芹菜、青藥芹、細葉芹菜。體外ACE抑制活性較高的幾個品種如細葉芹菜、青梗芹菜等，其總酚或總黃酮含量也較高，說明體外ACE抑制活性與總酚或總黃酮含量有一定相關性。空桿芹菜的總酚和總黃酮含量較低，但其體外ACE抑制活性卻較高，說明總黃酮或總酚含量與ACE抑制活性不完全成正相關，體外ACE抑制活性可能是受其他水溶性成分影響。進一步對不同品種芹菜葉體外ACE抑制活性、總黃酮含量和總酚含量進行相關性分析，結果如表2所示，體外ACE抑制活性與總酚、總黃酮含量均呈正相關，相關系數介于0.3～0.6，說明芹菜葉體外ACE抑制活性與其總黃酮、總酚含量有弱相關性。

表2 不同品種芹菜葉的體外ACE抑制活性、總黃酮含量和總酚含量的相關性

在同一行中顏色越深、數字越大表示體外ACE抑制活性或總酚、總黃酮含量越高，圖中芹菜品種編號與表1對應。

2.4 不同品種芹菜葉和莖的體外ACE IC50值

以芹菜葉體外ACE抑制活性為主指標，芹菜葉總酚和總黃酮含量為輔助指標，在19種芹菜品種中篩選出較好的8種，分別為四季慢芹菜、紫芹、白藥芹、白梗芹菜、青梗芹菜、重慶白芹菜、細葉芹菜、青藥芹。考慮到可食用部分莖葉中的活性成分有一定的關聯性，為進一步篩選高活性芹菜品種，分別測定葉和莖的體外ACE IC50，其值越小表示ACE抑制活性越高。從圖3可看出，各品種芹菜葉的ACE IC50約為莖的1/3，說明芹菜葉對ACE的抑制效果顯著(P<0.05)好于芹菜莖。白藥芹葉的體外ACE IC50最大，為5.063 mg·mL-1，青梗芹菜葉和四季慢芹菜葉的最小，分別為1.258 mg·mL-1和1.368 mg·mL-1，說明其對血管緊張素轉化酶抑制效果最好，其體外降壓活性最高；其次為白芹菜(1.829 mg·mL-1)、白梗芹菜(2.298 mg·mL-1)、紫芹(2.591 mg·mL-1)、細葉芹菜(2.642 mg·mL-1)、青藥芹(3.835 mg·mL-1)。

柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖中芹菜品種編號與表1對應。

3 結論與討論

芹菜來源廣泛，是人們日常食用的蔬菜之一，但是在平時食用習慣中會丟棄芹菜葉而食用芹菜莖。本實驗結果表明，芹菜葉體外ACE IC50約為莖的1/3，說明芹菜葉中降血壓物質含量遠高于芹菜莖。孫華林等[12]研究表明，在芹菜根、莖、葉3個部位中，芹菜葉對調節大鼠高血壓和血脂代謝絮亂的效果最明顯，本實驗結果與此一致。Che等[21]研究表明，水提可以提高天然產物的生物活性，在提取溫度較高時不僅利于水溶性降血壓活性物質的提取，還利于部分可溶于熱水的黃酮類物質提取，這可能是本研究中芹菜葉水提物比醇提物的體外ACE抑制活性更高的原因。賈麗麗等[22]研究表明，不同芹菜品種之間營養成分含量差異較大，本研究中不同芹菜品種之間體外ACE抑制活性亦有差異，不同品種芹菜其性狀也不同，有的品種芹菜葉顏色較深如紫芹，有的品種芹菜葉顏色較淺如白芹。花色苷具有降血壓作用[23]，Ojeda等[24]發現，飛燕草色素-3-O-桑布雙糖苷和矢車菊素-3-O-桑布雙糖苷對血管緊張素轉換酶具有競爭性抑制作用。本實驗中不同芹菜品種的體外ACE抑制活性不同可能與其所含的花色苷含量不同有關，因為深色葉如紫芹葉通常富含花色苷。

通過對四季慢芹菜、紫芹、白藥芹等19個芹菜品種的體外ACE抑制活性及其總黃酮和總酚含量的測定，選出紫芹、青梗芹菜、細葉芹菜、青藥芹等8個活性較高的芹菜品種。青梗芹菜葉體外ACE半抑制率最低，其次為四季慢芹菜葉，對ACE抑制效果由高到低為青梗芹菜、四季慢、白芹菜、白梗芹菜、紫芹、細葉芹菜、青藥芹和白藥芹。本文篩選出的青梗芹菜、紫芹等品種可以作為芹菜降血壓活性成分研究與利用的優選品種。

致謝：感謝桐鄉市鳳鳴衛杰家庭農場時衛杰對本實驗芹菜栽培提供的幫助。