油茶組織培養研究進展

李春永

（廣東省德慶林場，廣東 廣州 526600）

1.關于油茶

1.1 油茶

油茶（Camellia oleifera Abel.）是山茶科山茶屬植物，為常綠小喬木或灌木，是指山茶屬植物中種子含油率較高、有栽培應用價值的一類物種的總稱。油茶主要分布在我國長江流域及其以南的省份和自治區，主要包括普通油茶、小果油茶、枚縣油茶、浙江紅花油茶、廣寧紅花油茶、騰沖紅花油茶、越南油茶等10多個種。

1.2 油茶的作用

油茶是我國重要的木本油料樹種，具有悠久的栽培歷史和重要的經濟價值，在我國國民生產和人民生活中占據著重要的地位。油茶的主要產品是茶油，茶油中不飽和脂肪酸高達 90%左右，還富含脂溶性 VA、VE、VK，可預防心血管硬化，降血壓，降血脂等，被公認為是一種理想的營養保健食用油，已被國際糧農組織列為重點推廣的健康型高級食用植物油。

此外，茶油還被廣泛地應用于工業、醫藥、化妝業領域中，具有很高的經濟價值。油茶還是一種優良的荒山荒地綠化樹種，尤其是對于維護我國南方丘陵紅壤地區的生態穩定性起著十分重要的作用，具有綠化美化環境、凈化空氣、調節氣候、保持水土、涵養水源等多種生態效益，是我國南方丘陵紅壤地區的先鋒闊葉樹種和主要造林綠化樹種。

2.油茶組培

2.1 油茶產業現狀

油茶雖在我國栽培歷史悠久，但目前對油茶的開發、研究、應用仍不盡人意，盡管在育種、種植、管理等方面取得諸多成果，但油茶生產長期以來一直采用自然實生繁殖、品種良蕎不齊、粗放經營，全國總產量很低，栽培面積也大幅度的減少，起經濟效益并未能得到充分發揮。

目前，國內主要采用油茶優良無性系造林，雖然該方法在一定程度上提高了茶油的產量和品質，但油茶優良無性系繁育所需的時間較長，而且造林成活率極不穩定，在采穗圃繁育中還容易受病毒感染而出現容易老化的現象，極大地影響到油茶優良無性系的推廣和應用，仍遠不能滿足速生豐產油茶育苗的需求。全國油茶產業發展規劃要求在近10年內發展新造油茶林165.80萬hm2，經初步估算，需優質苗木60多億株，就現有供苗能力計算，年均缺口3.67億株，因此，良種苗木供應是油茶產業快速發展的瓶頸。

2.2 油茶組培的意義

油茶優良無性系再生植株同原無性系無明顯差別，用組培快繁獲得組培苗木能夠保持原無性系的優良特性，其遺傳也是穩定的。為了盡快解決良種苗木供需矛盾，推進良種發展進程，林業科技人員正在深入研究油茶組培技術。通過建立油茶無性組織培養的快繁體技術建立規模化培育技術，生產整齊一致的高產優良無性系苗木，用于更新造林或新林營造。組織培養對油茶優良種質資源和性狀的保存有著深遠而重大的意義，對油茶產業的發展也將產生重要影響。

2.3 油茶組培概況

但是油茶細胞不易誘導分化，細胞不易誘導分化成再生植株，組織培養難度較大目前國內外相關的報道較少。而且我國在油茶組織培養在油茶育苗上的研究開展較晚，，進展緩慢，技術很不成熟，應用也較少。

國內最早關于油茶組織培養的研究是顏慕勤于1980年報道的，主要通過組織培養誘導出了胚狀體，通過胚狀體形成再生植株。1981年和1982年，隆振雄和盧天玲先后分別利用油茶未成熟子葉幼胚離體培養獲得再生植株，此后，隆振雄對油茶花藥培養進行了研究，通過組織培養誘導產生了愈傷組織，并獲得了綠色芽點和根，但未獲得再生植株。隨后20年油茶組織培養的研究工作基本處于停滯狀態。2002-2004年，畢方鋮等對油茶的莖段、幼胚、子葉在離體條件下進行誘導，獲得再生植株，揭示了油茶胚狀體起源于單細胞原胚或者多細胞團，胚狀體多從表皮細胞的胚性愈傷組織誘導產生，篩選出了再生叢芽、子葉形成胚性愈傷組織及其不定芽分化的最適培養基配方;還通過RAPD鑒別分析，在DNA水平上均未發現變異，說明通過組織培養建立的油茶優良無性系再生植株無變異，最終獲得的組培苗木能夠保持原無性系的優良特性，其遺傳是穩定的，為油茶優良無性系組培擴繁和生物技術育種的再生體系建立打下了基礎。

花藥培養技術在育種方面有著眾多優勢，如：純合速度快，可以加快育種進程；選擇效率高，準確性高；克服遠緣雜交不育；能夠創造新種質，可與分子標記技術相結合等。目前，我國關于花藥培養的研究在世界上處于領先水平，該技術在部分林木物種改良中的成功應用為我國油茶的種質改良帶來了一條新途徑。花藥培養技術在我國油茶品種改良中的應用研究剛剛開始，以花藥培養為主的單倍體育種技術在植物種質改良方面具有重要作用，單倍體育種技術具有其他種質改良方法所不可比擬的優良特性，如能將其盡快應用到油茶的種質改良中，將會大大促進我國的油茶生產。但目前對油茶花藥培養的研究僅見少量報道，且尚未有分化單倍體植株的報道。

3.影響油茶組培的因素

3.1 外植體的選擇

主要是取材時期以及取材部位。

取材時期對植物花藥愈傷組織發生有顯著的影響。一般認為一年中的7月是油茶組織培養的最佳外植體采集時期。普通油茶、小果油茶、浙江紅花油茶、廣寧紅花油茶均是在盛花初期所采樣品的誘導率高于盛花末期所采樣品的誘導率。范曉明等認為攸縣油茶花粉四分體時期為油茶花藥愈傷組織誘導的最佳時期。

油茶的未成熟果實、花藥、子葉、幼胚、腋芽、莖尖、節間、下胚軸都可以作為外植體。丁植磊等認為壯齡油茶植株背陰面、枝條下部采摘適合的花蕾進行試驗能獲得較高的油茶愈傷組織誘導率和繼代培養增殖效果。黃莉稚的研究發現，采用1年生油茶扦插新抽的嫩芽作為外植體比采用3年生新抽嫩芽作為外植體能更有效的提高誘導率，同時降低污染率和褐化率。

3.2 外植體的預處理

能否有效地控制微生物污染是油茶無性系組織培養能否成功的關鍵技術之一，外植體的消毒是一個至關重要的環節。常用的酒精配合升汞對油茶果表面消毒處理非常有效。外植體消毒時，消毒藥劑濃度太低，時間太短，不利于污染的控制; 消毒藥劑濃度太高，時間太長，則會破壞外植體的細胞，由于細胞對自身的保護，會不斷產生大量次生物質，從而引起細胞毒害，產生褐化甚至死亡，導致外植體的成活率下降。黃莉雅等的研究發現，75%酒精消毒30s，0. 1%HgCl2消毒6min左右，基本上能達到較好的消毒效果。蔡玲等的研究，發現采用0.2 %的 HgCl2消毒處理油茶種胚外植體10 min 效果較好采用。而畢方鋮等的研究發現，用2.5%次氯酸鈉、消毒時間20min對油茶腋芽消毒效果最好，芽的萌發誘導率達85%，而污染率只有10%。龔斌等發現，外植體采回后放在 6%CaCl2溶液中常壓下浸泡15min，效果較好。

另外，低溫預處理有利于油茶花藥愈傷組織的誘導，只是不同物種的最佳處理時間不同。普通油茶和小果油茶的花藥愈傷組織經過低溫預處理后，誘導效率均達到了70%以上。而也有研究發現攸縣油茶不做低溫預處理其平均誘導率最高( 51. 79 %) ，隨著低溫預處理天數的增加，誘導率逐漸減低。

離心預處理同樣可以提高誘導率。

3.3 培養基的選擇及激素配比

選擇合適的培養基和適當的激素配比是油茶組織培養成功的關鍵因素之一。不同培養基對油茶苗生根的影響存在明顯差異。在油茶組培中，培養基一般有N6、MS、White、改良ER，MS培養基有利于愈傷組織生長增殖，是最常用的培養基，尤其在花藥培養方面。材料不同，對激素種類、濃度的反應也不同；不同培養階段對激素的要求也不同，生長素與細胞分裂素以適當的比例使用時，對于愈傷組織的誘導是有利的。最常用的激素有NAA和6-BA，2，4-D有利于細胞迅速增殖和愈傷組織形成，細胞分裂素KT、ZT和6-BA可促進花粉胚的形成。誘導分化培養在 6- BA 與 ZT、CH 按一定的濃度配比使用， 對叢生芽的分化有顯著的促進作用。

油茶花藥培養中培養基組分和激素的作用比較復雜，改良的誘導培養基在繼代過程中仍作用良好，而6-BA與NAA組合對小果油茶增殖表現良好，與誘導培養基相當；KT與NAA組合對多齒紅花油茶增殖明顯優于改良過的誘導培養基，且綠色芽點增多，褐化狀況好轉；這兩種激素組合均為進行油茶花藥愈傷組織誘導試驗的適宜組合。

吳幼媚等的研究發現，1/2ER 為油茶組織培養最適基本培養基；ABT60. 5mg / L + IAA 2. 0 mg / L + NAA0. 8 mg /L為最優的激素濃度組合，組培單芽培養40天生根率達93. 7 %，每個單芽長根3～4條。

彭秋發等[的研究發現，攸縣油茶誘導胚性愈傷組織分化為胚狀體的最佳培養基為 MS+2.0 mg/L6！BA+ 0.6 mg/LNAA。

范曉明等的研究發現，油茶幼胚再生植株誘導最適培養基的理論值為WPM＋2.0 mg/L 6-BA＋1.5mg/L NAA；子葉胚性愈傷組織誘導的最適培養基為WPM＋1.0 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L NAA；子葉胚性愈傷組織的最適分化培養基為MS＋2.0 mg/L 6-BA＋0.01 mg/L NAA。

楊育紅等發現，在愈傷組織誘導中2，4-D是主要影響因素，其次為NAA和BA。當NAA0.5mg/L、BA2.0mg/L時，愈傷組織的分化率達到84.9%。，隨著2，4-D濃度的升高，愈傷組織的分化率有所上升，當把子葉接到MS+2，4-D0.5+NAA0.5+BA0.5+3%蔗糖的培養基時，材料在20d內全部愈傷化，且整塊愈傷組織極度膨大，結構疏松。

也有研究發現，油茶幼胚和子葉對培養基要求不是很嚴格。

3.4 培養條件

培養溫度、濕度、光照、培養時間等都對褐變有很大影響，同樣影響著油茶花藥培養誘導率的高低。

溫度對花藥培養的影響很大。一般花藥培養溫度采用24-28℃。研究表明，變溫處理即在高溫下處理一段時間之后再轉至低溫培養有利于提高胚狀體的誘導率。

在黑暗條件下培養油茶花藥有利于愈傷組織的發生，雖生長緩慢，但經暗培養的愈傷組織綜合評價指數最高，黑暗培養是油茶花藥愈傷組織誘導階段的重要條件。一般來說，接種后先暗培養5-10d后再進行光照處理對愈傷組織和芽的萌動和分化有利，而黃莉雅等得到的結果有所不同。

接種后暗處理，可在一定程度上減輕褐化反應。

在早期誘導花藥脫分化產生愈傷組織時，需要在黑暗條件下培養，而誘導胚狀體和芽的分化培養，需要一定時間的最低光強的光照處理；光質對植株的再生有不同的影響，往往光合的作用光譜對再生作用最有效。

3.5 添加劑

培養基高壓滅菌后或培養過程中會積累一些有毒物質，對外植體或愈傷組織有一定的毒害作用。油茶組織中酚類物質含量較高，酚類的糖苷化合物是木質素、單寧和色素的合成前體；因此，當酚類化合物含量高時，木質素、單寧或色素形成就多，易導致褐變的發生。嚴重的褐化現象會抑制誘導愈傷組織產生，甚至出現死亡。能否有效地控制褐變也是油茶花藥培養能否成功的關鍵。

在培養基中添加活性炭、VC等物質，吸附或去除培養基中的某些毒性物質從而促進愈傷組織的分化和再生綠苗的生長。活性炭、VC 和AgNO33 種添加劑能顯著降低花藥愈傷組織誘導過程中的褐化率。但是，活性炭的吸附作用是沒有選擇性的，在吸附褐變物質的同時，也會吸附培養基中的生長調節物質，而使其失去作用；因而對外植體的誘導愈傷組織會產生一定的負面影響。聞麗等的研究也發現，添加5g / L活性炭后，普通油茶、小果油茶、浙江紅花油茶、廣寧紅花油茶愈傷組織的誘導率全部下降。

附加有機物、重金屬類等在花藥培養中也有一定促進作用。據報道，在培養基中附加多種氨基酸，如谷氨酞胺、絲氨酸、脯氨酸、精氨酸、天門冬氨酸和丙氨酸，可以顯著提高花粉胚及植株的獲得率。水解乳蛋白在柑橘花藥培養中對花粉胚的發育有利。

3.6 糖源

蔗糖是主要的碳源，且具有滲透壓調節作用，在培養基中蔗糖用量對愈傷組織誘導率、綠苗和白苗分化率均有影響，一般愈傷組織誘導反應出低濃度有利于綠苗分化，濃度過高促進白苗分化的傾向。聞麗等的研究表明，30g /L和40g / L蔗糖質量濃度培養基的花藥愈傷組織的誘導率顯著高于蔗糖質量濃度為20g / L和50g / L的處理，其誘導率均值分別為47.89%、51.19%，蔗糖質量濃度過高或過低，花藥愈傷組織的誘導率均呈明顯下降趨勢。

用麥芽糖代替蔗糖可提高花培綠苗率。

4.油茶組培存在的問題

4.1 褐化問題

油茶組織中酚類物質含量較高，酚類的糖苷化合物是木質素、單寧和色素合成的前體。因此，當酚類化合物含量高時，木質素、單寧或色素形成就多，易導致褐變的發生，有些細胞會因褐變而死亡。通過對油茶帶腋芽莖段培養，發現油茶組織培養褐變發生程度與培養溫度、培養基中激素濃度和無機鹽含量等因素有關；較高的培養溫度、培養基中較高濃度的無機鹽、較高濃度的激素及木質化程度高的外植體都會促進褐化的發生。

4.2 污染問題

能否有效地控制微生物污染是油茶無性系組織培養能否成功的關鍵技術之一。在油茶無性系組織培養中污染可分為外植體、培養基和無菌操作3個方面，其中以外植體方面的污染最復雜，也最難控制。

4.3 生根難

油茶生根有相當大的難度，在油茶幼苗的生根培養中，用NAA和IBA產生的生根效果均較好，且出根快，但獲得的再生苗大多只有一條主根，須根很少。在空氣中未接觸培養基所形成的不定根，卻有很多白色絨毛狀的須根出現，但很細弱，在繼代培養中易折斷，這可能與油茶的遺傳特性(主根性明顯)有關。

5.展望

油茶所具有的增產潛力一直為眾多專家看好，我國在油茶品種改良方面的研究工作也做了許多，但是一直未能取得顯著的效果。現代組培技術的發展，尤其是花藥培養技術在其他作物育種方面的應用所表現出來的優良特性，使我們看到了油茶育種改良的新的希望。關于油茶花藥培養的研究仍處于初級階段，如果能夠篩選出合適的花藥培養橋梁親本組配雜交組合，找到最佳的油茶花藥培養技術，再結合常規的育種方法，在油茶育種改良中運用，無疑將會為我國的油茶改良工作帶來振奮人心的喜訊。目前有關這方面的研究工作幾乎還沒有開展，但是這將是一個很有前景的研究方向。