miR-145 對三陰性乳腺癌細胞增殖、侵襲及轉移能力的影響

朱凌霄 張 蘭 張雪鵬 李昊鑫

華北理工大學附屬醫院腫瘤外科，河北唐山 063000

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌中一種難治性亞型，由于缺乏特異性受體，目前TNBC 主要采用傳統的化療和手術治療，但預后較差，所以尋找新的治療手段，尤其是靶向治療是目前的研究熱點[1-2]。微RNA（microRNA，miRNA）是強大的“基因調節劑”，其中miR-145 作為表達較為顯著的一類抑癌基因，可抑制TNBC 的增殖、轉移及侵襲[3-4]。本課題組前期發現，miR-145 通過調控解聚素-金屬蛋白酶17（adisintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17）可影響MCF-7 乳腺癌細胞的增殖和侵襲[5]。為進一步觀察其在TNBC 中的作用，本研究在降低TNBC 細胞中miR-145 的表達水平后，通過測定和分析下游ADAM17 及與其密切相關的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）相關指標的變化后，觀察其對TNBC 細胞增殖和侵襲的影響，并探討其作用機制，為TNBC 的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人TNBC MDA-MB-231 細胞株（CL-0150）購于武漢普諾賽生命科技有限公司；miR-145 無義序列（miR2N0000001-1-1）、miR-145 inhibitors（miR20000）以及引物（miR01101）均由廣州銳博生物科技有限公司設計與合成；Leibovitz L-15 培養基（10-045-CVR）購于美國Corning 公司；胎牛血清（A0100-3210）購于德國Cegrogen 公司；實時聚合酶鏈反應試劑盒（RK21 203）購于武漢愛博泰克生物科技有限公司；Lipofec tamine 2000 試劑（11668027）購于美國Invitrogen 公司；ADAM17（GTX101358）購于美國GeneTex 公司；EGFR抗體（ARG66204）購于上海Arigo 公司。

1.2 細胞培養及分組

使用L-15 完全培養基（含10%胎牛血清和1%雙抗）培育本研究的目標細胞，MDA-MB-231 細胞置于37℃、無CO2的飽和濕度培養箱中培養，實驗分為空白組（細胞無特殊處理）、miR-145 NC 組（轉染miR-145 無義序列）、miR-145 inhibitors 組（轉染miR-145 inhibitors）。轉染后分析確定各組miR-145 的表達水平以及轉染效率。

1.3 實時聚合酶鏈反應檢測各組miR-145 和ADAM17、EGFR mRNA 的表達

細胞轉染后繼續在細胞培養箱中培養48 h，Trizol 法提取各組的總RNA，利用逆轉錄試劑盒（銳博生物，ZR102-2）合成cRNA。以U6 和β-actin 分別作為miR-145 和ADAM17、EGFR 的內參，進行PCR 擴增。在電腦上預先設置好反應需要的相關程序，并按順序進行45 個循環，過程主要包括：預變性（95℃，10 min）、變性（95℃，10 s）、退火（56℃，25 s）、延伸（72℃，1 min）。反應完畢后收集各組數據，各組mRNA 的表達量用相對定量法表示。實驗所需引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.4 Western blot 檢測各組ADAM17 及EGFR 蛋白的表達

不同處理組細胞轉染48 h 后，提取各組細胞的總蛋白并測定蛋白濃度。配制SDS-PAGE 膠并進行凝膠電泳，而后進行電轉以及封閉，置于一抗工作液中，4℃冰箱中孵育過夜。次日置于二抗工作液中孵育，凝膠成像儀對條帶進行顯像并分析光密度（optical density，OD）值。

1.5 CCK-8 法測定細胞增殖活性

不同處理組細胞轉染成功后接種于96 孔板中培養，每組可設3 個復孔。分別在轉染后24、48、72 h 時加入CCK-8 試劑，并檢測各孔的OD 值（450 nm）并記錄。

1.6 Transwell 實驗檢測各組細胞的侵襲能力

轉染成功后的各組細胞培養24 h 后進行消化重懸，加入提前鋪好Matrigel 基質膠的小室中（約5×105個細胞/孔）。同時Transwell 下室加入L-15 完全培養基，36 h 后對侵襲細胞進行固定以及著色。待其明顯著色后在顯微鏡下進行計數，記錄各組細胞的穿膜數目。

1.7 細胞劃痕實驗觀察細胞的遷移能力

各組MDA-MB-231 細胞轉染成功6 h 后，用100 μl 無菌槍頭對三組細胞劃3 條直線，此時記為劃痕實驗0 h，計時24 h，觀察并記錄轉染后顯微鏡下細胞的形態以及分布。

1.8 統計學方法

使用SPSS 23.0 軟件對數據進行分析，計量資料用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗。以P <0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Lipofectamine 2000 介導的miR-145 轉染率比較

miR-145 inhibitors 組miR-145 表達量低于miR-145 NC 組，差異有統計學意義（P<0.05）；miR-145 NC組與空白組miR-145 表達量比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖1。

圖1 Lipofectamine 2000 介導的miR-145 轉染率比較

2.2 各組MDA-MB-231 細胞增殖情況比較

空白組與miR-145 NC 組比較：轉染后時間比較，差異有統計學意義（P <0.05），而組間、交互作用比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。進一步兩兩比較，組內比較：轉染后72 h，空白組、miR-145 NC 組OD值均大于轉染后24 h，差異有統計學意義（P ＜0.05）。組間比較：轉染后24、48、72 h，miR-145 NC 組與空白組OD 值比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表2。

miR-145 NC 組與miR-145 inhibitors 組比較：轉染后時間、組間、交互作用比較，差異有統計學意義（P <0.05）。進一步兩兩比較，組內比較：轉染后72 h，miR-145 inhibitors 組OD 值大于轉染后24、48 h；差異有統計學意義（P ＜0.05）。組間比較：轉染后72 h，miR-145 inhibitors 組OD 值大于miR-145 NC 組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。轉染后24、48 h，miR-145 inhibitors 組與miR-145 NC 組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 各組轉染后不同時間點OD 值比較（，n=3）

表2 各組轉染后不同時間點OD 值比較（，n=3）

注：空白組與miR-145 NC 組比較：F時間=1059.059，P時間＜0.001；F組間=0.442，P組間=0.543；F交互=5.109，P交互=0.087。miR-145 NC組與miR-145 inhibitors 組比較，F時間=281.070，P時間＜0.001；F組間=20.413，P組間=0.011；F交互=73.391，P交互=0.001。與本組轉染后24 h比較，aP ＜0.05；與本組轉染后48 h 比較，bP ＜0.05；與miR-145 NC 組同期比較，cP ＜0.05

2.3 各組細胞侵襲能力比較

miR-145 inhibitors 組跨膜細胞數多于miR-145 NC 組，差異有統計學意義（P<0.05）；miR-145 NC 組與空白組跨膜細胞數比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖2～3。

圖2 各組細胞的跨膜結果（200×）

圖3 各組細胞侵襲能力比較（n=3）

2.4 各組細胞的遷移能力比較

miR-145 inhibitors 組劃痕愈合率高于miR-145 NC 組，差異有統計學意義（P <0.05）；miR-145 NC 組與空白組細胞愈合率比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖4～5。

圖4 各組細胞的遷移情況（200×）

圖5 各組劃痕愈合率比較（n=3）

2.5 各組ADAM17、EGFR mRNA 的表達情況比較

miR-145 inhibitors 組ADAM17 mRNA 相對表達量高于miR-145 NC 組，差異有統計學意義（P<0.05）；miR-145 NC 組與空白組ADAM17 mRNA 相對表達量比較，差異無統計學意義（P >0.05）。miR-145 inhibitors 組 和miR-145 NC 組EGFR mRNA 的 相 對表達量比較，差異無統計學意義（P >0.05）；miR-145 NC組與空白組EGFR mRNA 相對表達量比較，差異無統計學意義（P >0.05）。見圖6。

圖6 各組ADAM17、EGFR mRNA 的表達情況比較（n=3）

2.6 各組ADAM17、EGFR 蛋白表達情況比較

miR-145 inhibitors 組ADAM17、EGFR 蛋白相對表達量高于miR-145 NC 組，差異有統計學意義（P <0.05）；miR-145 NC 組與空白組ADAM17、EGFR 蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P >0.05）。見圖7～8。

圖7 Western blot 檢測各組ADAM17、EGFR 蛋白條帶

圖8 各組ADAM17 和EGFR 的蛋白表達量比較（n=3）

3 討論

臨床上TNBC 生存率低，復發率高，早期容易發生轉移且侵襲性較其他亞型強[6]。由于TNBC 特殊的生物學特性（多種受體表達明顯缺陷），現有的分子靶向治療并不能獲得較好的臨床效果。而目前主要采用傳統的化療和手術治療方式在大約30%的TNBC 患者中可以有效地發揮作用，但許多患者對于上述治療方式沒有反應或只有部分反應，且最終以遠處轉移的形式復發，可以說目前臨床上患者的預后及生存期仍然不甚理想，所以尋找TNBC 的治療靶點迫在眉睫[7-8]。已有研究證明，在miRNA 家族中存在很多與腫瘤發生發展息息相關的miRNA，他們通過與目標mRNA 結合并激發原癌基因或者抑癌基因的表達，參與了腫瘤的發生發展乃至預后的過程，即有的miRNA 促進腫瘤的增殖與侵襲，而有的miRNA 則參與負向調控腫瘤的生物學進程[9-10]。眾所周知，miR-145 作為抑癌效果顯著的miRNAs 之一，已經被證明與許多惡性腫瘤的病理進程有緊密的聯系，比如在甲狀腺惡性腫瘤中，miR-145 主要是靶向抑制PI3K/AKT3 信號通路，從而抑制甲狀腺癌細胞的多種生物學特性[11]。當然，miR-145 靶向調控不同的信號通路來影響惡性腫瘤細胞增殖、侵襲等生物學行為的這一特性在胃癌、結直腸癌等疾病中亦有顯著表現[12-13]。所以miR-145 有可能作為乳腺癌的治療靶點[14]。本課題組前期研究證實，miR-145 過表達抑制MCF-7 乳腺癌細胞的增殖及侵襲[15-16]。我們進一步研究抑制miR-145 的表達對TNBC 細胞的影響，主要應用增殖實驗（CCK-8 實驗）以及Transwell 實驗和細胞劃痕實驗證明miR-145 在TNBC 細胞中表達明顯受到抑制時，可以有效促進細胞的生長增殖以及侵襲和遷移能力。

本實驗還探究了miR-145 在TNBC 中可能存在的作用機制，通過分別檢測ADAM17 和EGFR 在細胞中的表達變化，發現ADAM17 mRNA 和蛋白質水平均上調；而EGFR mRNA 水平無變化，但蛋白表達水平上調。提示miR-145 可能直接調控ADAM17，但不直接調控EGFR。查閱文獻發現，在許多惡性腫瘤的發生發展過程中，miR-145 均可通過靶向調控ADAM17 來參與病理進程[17-18]。前期研究發現，miR-145 與ADAM17 存在堿基互補序列，這一信息主要來源于生物學信息庫（TargetScan、PicTar 及miRanda），并據此預測了二者的關聯性[16]。提示miR-145 靶向調控ADAM17 的信號通路在TNBC 中存在合理性。研究顯示，EGFR 在惡性腫瘤發生發展的信號通路中，是通過被上游的ADAM17 錨定以及激活后，經歷自身的二聚化以及磷酸化的過程，進而繼續激活下游的差異信號通路，從而調控多種腫瘤發生機制[19-20]。本研究中EGFR 蛋白水平上調，可能是因為ADAM17 上調，其作為下游，蛋白表達亦升高，查閱相關文獻亦支持這一結論[21]。

綜上，miR-145 inhibitor 通過靶向激活ADAM17/EGFR 通路，促進TNBC 細胞的增殖、侵襲和遷移。這可能為未來TNBC 的臨床治療提供新的分子靶點和治療思路。