豬圓環(huán)病毒2型繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染診斷

羅布扎西，聶民財(cái)，徐志文，周遠(yuǎn)成

（1.西藏自治區(qū)錯(cuò)那縣浪坡鄉(xiāng)農(nóng)牧綜合服務(wù)中心，西藏 錯(cuò)那 856700；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130；4.四川省畜牧科學(xué)研究院畜禽生物制品四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066）

豬圓環(huán)病毒是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒，是目前已知的最小的動(dòng)物DNA 病毒，主要分為三個(gè)血清型，其中2 型的致病力最強(qiáng)。PCV2（圓環(huán)病毒2 型）在豬群中傳染性較強(qiáng)，能夠通過口腔、呼吸道進(jìn)行傳播，懷孕母豬感染后亦可經(jīng)胎盤引起垂直傳播。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬的單股正鏈RNA 病毒，PRRSV于1987年首次在美國發(fā)現(xiàn)。PRRSV只感染豬，各種日齡、品種的豬都可以感染此病毒，其中日齡在1月以內(nèi)的仔豬和妊娠母豬最易感。病仔豬以出現(xiàn)呼吸道癥狀為主，感染母豬則出現(xiàn)繁殖障礙。

1 材料與方法

1.1 病料 病料采集于出現(xiàn)喘氣、發(fā)燒和腹瀉癥狀的豬，包括患豬的血液、腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、肺臟以及小腸等。

1.2 試劑與材料 DL 2 000 Marker、dd H2O、Trizol 細(xì)胞裂解液、RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×Taq PCR Master Mix，通用型基因組DNA提取試劑盒。

1.3 樣品處理 血液樣品分裝于無菌EP 管中，5 000 r∕min離心5 min，取上清液備用。

淋巴結(jié)、脾臟、肺臟和小腸等組織樣品剪碎、研磨后加3 mL PBS 制成組織懸液，放置于-20 ℃凍融3次，12 000 r∕min離心5 min，取上清液備用。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 已登錄的偽狂犬病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）、流行性腹瀉病毒（PEDV）、傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、輪狀病毒（PoRV）、細(xì)小病毒（PPV）、δ-冠狀病毒（PDCoV）、圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的基因序列，利用DNAMan 軟件分析保守序列并設(shè)計(jì)引物（表1）。

1.5 核酸提取及PCR 檢測（表2、表3）總RNA提取：使用Trizol 法提取病料的總RNA，得到總RNA 后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，使用CSFV、PEDV、TGEV、PORV、PRRSV 特異性引物分別進(jìn)行RT-PCR檢測。

表2 RT-PCR/PCR反應(yīng)體系

表3 RT-PCR/PCR反應(yīng)程序

總DNA 提取：使用通用型DNA 提取試劑盒提取病料總DNA，使用PRV、PPV、PCV 特異性引物進(jìn)行PCR檢測。

2 結(jié)果

通過對幾種病毒進(jìn)行特異性PCR 檢測，CSFV、PEDV、TGEV、PPV、PRV、PORV 結(jié)果均為陰性，PCV2 PCR 結(jié)果中均為陽性（見圖1），PRRSV RT-PCR 結(jié)果中血液樣本和肺臟樣本表現(xiàn)為陽性（見圖2）。根據(jù)檢測，診斷本次豬病為PCV和PRRSV混合感染所致。

圖1 PCV2 PCR檢測結(jié)果

圖2 PRRSV RT-PCR檢測結(jié)果

3 小結(jié)

豬圓環(huán)病毒和繁殖與呼吸綜合征病毒均能攻擊豬只的免疫系統(tǒng)，使患病豬出現(xiàn)免疫抑制，進(jìn)而繼發(fā)感染其他病毒或細(xì)菌，出現(xiàn)混合感染。生產(chǎn)中豬圓環(huán)病毒和繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染較常見。

當(dāng)豬發(fā)生圓環(huán)病毒病和繁殖與呼吸綜合征時(shí)，豬因免疫抑制而繼發(fā)感染其他疾病是給豬場造成嚴(yán)重?fù)p失的主要原因。當(dāng)豬出現(xiàn)二病感染時(shí)應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)其他病毒性疾病和細(xì)菌性疾病的防控。

防控發(fā)病應(yīng)將病死豬及污染物無害化處理；病豬和可疑病豬單獨(dú)隔離飼養(yǎng)，并加強(qiáng)其他常見病毒性疾病的免疫；加強(qiáng)環(huán)境消毒，每天對豬場進(jìn)行兩次消毒；做好豬場人員的管理，嚴(yán)禁外來人員進(jìn)入養(yǎng)殖區(qū)域；做好飼養(yǎng)管理，避免豬因應(yīng)激反應(yīng)而導(dǎo)致免疫力下降。