中國(guó)沙棘和云南沙棘的遺傳分化及遺傳多樣性

王天翼，徐 悅，王羅云，張建國(guó)，曾艷飛

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國(guó)家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091)

沙棘（Hippophae rhamnoidesLinn.），又名醋柳、酸刺、黑刺等，屬胡頹子科（Eleagnaceae）沙棘屬（Hippophae），是二倍體（2n=24），落葉灌木或小喬木，雌雄異株，風(fēng)媒傳粉；主要分布于歐亞大陸，集中在溫帶和寒溫帶地區(qū)，生態(tài)幅極廣[1-4]。沙棘具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在開(kāi)發(fā)保健食品、藥品和化妝品上有著獨(dú)特的作用，還是很多偏遠(yuǎn)地區(qū)脫貧致富的經(jīng)濟(jì)來(lái)源。更重要的是，沙棘具有很高的生態(tài)價(jià)值，被廣泛應(yīng)用在治理荒漠化、退耕還林、植被綠化等方面[4-5]。

沙棘共包括了9個(gè)亞種[2-3]，起源于青藏高原，后多次擴(kuò)散至亞歐大陸其他地區(qū)[6]，其中，中國(guó)沙棘（H.rhamnoidessubsp.sinensis）和云南沙棘（H.rhamnoidessubsp.yunnanensis）是我國(guó)特有的沙棘亞種。中國(guó)沙棘葉常近對(duì)生，成狹披針形或矩圓披針形，葉背面銀白色、被鱗片，從西南到東北都有自然種群分布[7]，同時(shí)它也是我國(guó)栽培和種植歷史最悠久的一個(gè)亞種[8]。云南沙棘葉互生，基部最寬，常為圓形或有時(shí)楔形，葉背面灰褐色、被銹色鱗片，其分布范圍相對(duì)狹窄，多分布于西藏、四川和云南的交界地帶[7]。依據(jù)國(guó)家植物標(biāo)本資源庫(kù)（http://www.cvh.ac.cn/）、Global Biodiversity Information Facility（GBIF，https://www.gbif.org/）、國(guó)家資源標(biāo)本平臺(tái)（http://nsii.org.cn/2017/）和相關(guān)沙棘研究文獻(xiàn)等資料記載的沙棘分布點(diǎn)，中國(guó)沙棘和云南沙棘在地理上有分類(lèi)存在疑問(wèn)的區(qū)域，主要集中在四川省北部和中西部。中國(guó)沙棘和云南沙棘形態(tài)相似，并且具有不完全譜系分選，親緣關(guān)系較近，區(qū)分難度較大[8]。判定該區(qū)域種群基因流的變化、種群間的分界線(xiàn)，有利于明確遺傳擴(kuò)散適應(yīng)機(jī)制[9]。目前，有關(guān)中國(guó)沙棘和云南沙棘譜系地理的研究文獻(xiàn)以及標(biāo)本資源庫(kù)對(duì)于四川省北部和中西部沙棘的種類(lèi)歸屬問(wèn)題存在一定的分歧[8,10-11]。

本研究中，筆者利用18個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)來(lái)自32個(gè)自然種群的352個(gè)中國(guó)沙棘和云南沙棘個(gè)體和沙棘屬其他種和亞種的75個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳變異分析，以期探討以下問(wèn)題：（1）中國(guó)沙棘和云南沙棘是否存在明顯的遺傳分化？二者的物理分界線(xiàn)在哪？（2）中國(guó)沙棘和云南沙棘的遺傳多樣性分布如何？

1 材料與方法

1.1 樣本采集

從中國(guó)沙棘和云南沙棘的典型分布地區(qū)和分類(lèi)存疑地區(qū)采集了32個(gè)自然種群，共352個(gè)個(gè)體。因沙棘存在克隆繁殖，為了避免取到同一基因型個(gè)體，采集時(shí)不同樣品間至少間隔200 m。對(duì)所采集的個(gè)體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察以便初步定種，并記錄定位（表1）。為了明確中國(guó)沙棘和云南沙棘的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，還收集了沙棘屬其他種及亞種分別5～10個(gè)共75個(gè)個(gè)體用于分析（表1），包括蒙古沙棘（H.rhamnoidessubsp.mongolica）、溪生沙棘（H.rhamnoidessubsp.fluviatilis）、高加索沙棘（H.rhamnoidessubsp.caucasica）、中亞沙棘（H.rhamnoidessubsp.turkestanica）、海濱沙棘（H.rhamnoidessubsp.rhamnoides）、西藏沙棘（H.tibetana）、肋果沙棘（H.neurocarpa）、棱果沙棘（H.goniocarpa）、江孜沙棘（H.gyantsensis）、柳葉沙棘（H.salicofolia）。所有收集到的葉片均用變色硅膠干燥保存。

表1 沙棘種群采樣信息Table 1 Sampling information of sea buckthorn populations

1.2 DNA 提取和SSR 基因型檢測(cè)

葉片總DNA 的提取采用CTAB 植物基因組DNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物公司）。從沙棘基因組和轉(zhuǎn)錄組開(kāi)發(fā)的SSR 分子標(biāo)記[12]中選取18 對(duì)對(duì)所有個(gè)體進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)總體系為20 μL，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照王羅云等[13]的工作進(jìn)行。

用ABI 3730 測(cè)序儀（美國(guó)生命技術(shù)公司）對(duì)PCR 產(chǎn)物分析，內(nèi)標(biāo)選擇Liz500，結(jié)果經(jīng)由軟件Genemapper 4.0（美國(guó)生命技術(shù)公司）分析，對(duì)于SSR 基因型完全一致的潛在克隆株個(gè)體僅保留一份樣品，所得到數(shù)據(jù)均以大果沙棘品種“向陽(yáng)”為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

兩兩樣品間的遺傳距離由軟件MSA 4.05[14]計(jì)算，再用Phylip 3.695[15]軟件中的Neighbor 程序?qū)λ猩臣瑐€(gè)體以及中國(guó)沙棘和云南沙棘分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展值設(shè)置成1 000 次。

1.4 遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用Structure 2.3[16]軟件確定所采集中國(guó)沙棘和云南沙棘個(gè)體的遺傳分組情況。采用混合模型和等位基因頻率關(guān)聯(lián)模型，分組值K設(shè)置為1～10，每個(gè)K值重復(fù)計(jì)算10 次，每次運(yùn)行100 000 次Burnin和1000000次迭代[13]。將結(jié)果上傳到Structure Harvester（http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHa rvester/）中，根據(jù)lnP（D）和ΔK最大原則[17]選擇合適的K值，再通過(guò)Distruct 1.1[18]將結(jié)果可視化。

1.5 遺傳多樣性和遺傳分化分析

利用軟件GenAlEx 6.503[19]，計(jì)算中國(guó)沙棘和云南沙棘種群的遺傳多樣性參數(shù)，包括等位基因個(gè)數(shù)NA、有效等位基因個(gè)數(shù)NE、觀(guān)測(cè)雜合度HO、期望雜合度HE和近交系數(shù)FIS。利用MSA 4.05[14]計(jì)算遺傳分化系數(shù)FST，并進(jìn)行分子方差分級(jí)分析（Analysis of Molecular Variance，AMOVA）。

2 結(jié)果

2.1 中國(guó)沙棘和云南沙棘的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及遺傳結(jié)構(gòu)

基于SSR 基因型構(gòu)建的沙棘屬的5個(gè)種和7個(gè)亞種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果（圖1A）顯示：所有的中國(guó)沙棘都聚為一大支，而云南沙棘個(gè)體主要聚為4 支；除一支及少量個(gè)體與中國(guó)沙棘聚在一起外，其他3 支都和中國(guó)沙棘距離較遠(yuǎn)，其中，1 支由12個(gè)云南沙棘個(gè)體（圖1A 虛線(xiàn)部分）組成的分支與沙棘屬的其他4個(gè)種——西藏沙棘、肋果沙棘、江孜沙棘和柳葉沙棘聚在一起，這12個(gè)個(gè)體包括來(lái)自BS種群1個(gè)、XZD種群1個(gè)、XJ種群1個(gè)、BX種群7個(gè)、WL種群2個(gè)。中國(guó)沙棘和云南沙棘的個(gè)體單獨(dú)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1B）顯示：除6個(gè)云南沙棘個(gè)體（LX種群2個(gè)、LTB種群2個(gè)、CY種群1個(gè)、BS種群1個(gè)）與中國(guó)沙棘種群交叉聚在一起外，其余個(gè)體明顯地分為2 部分，各分支支持率大都不高（小于50%）；云南沙棘個(gè)體可分為a、b 2 支，其中，a 支為種群的個(gè)體與中國(guó)沙棘聚在一起，b 支為西藏、云南和四川中南部與中國(guó)沙棘距離較遠(yuǎn)；中國(guó)沙棘各分支支長(zhǎng)較短，差異不明顯，云南沙棘各分支支長(zhǎng)較長(zhǎng)，遺傳距離較遠(yuǎn)。

利用Structure 2.3[16]軟件，基于中國(guó)沙棘和云南沙棘個(gè)體SSR 基因型的分組分析顯示：lnP（D）在K= 2 時(shí)迅速增高，K>2 后趨于平緩（圖2A）；ΔK在K= 2 時(shí)有明顯峰值（圖2B）。因此，所有個(gè)體分2 組最合適，對(duì)應(yīng)與按初步形態(tài)分為中國(guó)沙棘和云南沙棘2個(gè)亞種（圖2C）。位于四川的MWS 和QY 2個(gè)種群的大部分個(gè)體表現(xiàn)為這2 組的中間基因型（圖2C），因此，后續(xù)分析將把MWS、QY 作為中間型種群。

2.2 中國(guó)沙棘和云南沙棘的遺傳多樣性

基于18個(gè)SSR 位點(diǎn)的中國(guó)沙棘遺傳多樣性參數(shù)（表2）表明：NA為1.7～4.9（平均3.5），NE為1.4～2.7（平均2.3），HO為0.213～0.528（平均0.402），HE為0.266～0.539（平均0.462）?；?8個(gè)SSR 位點(diǎn)的云南沙棘遺傳多樣性參數(shù)如下（表2）表明：NA為1.4～4.2（平均2.7）、NE為1.3～2.4（平均1.8）、HO為0.056～0.331（平均0.202）、HE為0.127～0.490（平均0.334）。中國(guó)沙棘和云南沙棘中HO最高的種群分別是YY 和KD，最低的種群分別為T(mén)W和PM。中國(guó)沙棘的NA、NE、HO、HE均值均高于云南沙棘。

2.3 中國(guó)沙棘和云南沙棘的遺傳分化

基于18 對(duì)SSR 標(biāo)記，中國(guó)沙棘兩兩種群間的FST為0.026～0.286，分化程度最低的為種群CFA和WC，分化程度最高的為種群TW 和HY；云南沙棘兩兩種群間的FST為0.069～0.539，分化程度最低的為種群LX 和SJS，分化程度最高的為種群LZ 和SJS；云南沙棘的FST值、FIS值普遍高于中國(guó)沙棘（表2、3）。AMOVA 分析顯示（表4）顯示：中國(guó)沙棘和云南沙棘亞種間遺傳變異占比為23.7%，亞種內(nèi)不同種群間占23.3%，種群內(nèi)個(gè)體間占53.0%。中國(guó)沙棘25.5% 的遺傳變異來(lái)自種群間，74.5%的遺傳變異來(lái)自種群內(nèi)個(gè)體間；云南沙棘種群36.7%的遺傳變異來(lái)自種群間，63.3%的遺傳變異來(lái)自種群內(nèi)個(gè)體間。

表2 本研究分析的30個(gè)沙棘種群的遺傳多樣性參數(shù)Table 2 The genetic diversity of 30 sea buckthorn populations

表3 中國(guó)沙棘（對(duì)角線(xiàn)左下方）和云南沙棘（對(duì)角線(xiàn)右上方）亞種內(nèi)不同種群間遺傳分化系數(shù)（FST）Table 3 Genetic differentiation coefficients (FST) between populations within H.rhamnoides subsp.sinensis (below diagonal) and within H.rhamnoides subsp.yunnanensis (above diagonal),respectively.

表4 中國(guó)沙棘和云南沙棘基于SSR 基因型的AMOVA 分析Table 4 AMOVA analysis based on SSR genotypes of H.rhamnoides subsp.sinensis and H.rhamnoides subsp.yunnanensis

3 討論

3.1 中國(guó)沙棘和云南沙棘的“邊界線(xiàn)”

依據(jù)標(biāo)本、文獻(xiàn)資料的記載，在四川省部分地區(qū)，中國(guó)沙棘和云南沙棘的分類(lèi)存在爭(zhēng)議。本研究基于18個(gè)SSR 位點(diǎn)的基因型，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和Structure 2.3[16]軟件分組結(jié)果都顯示，中國(guó)沙棘和云南沙棘可分成明顯的2 組，種群MWS 和QY 的大部分個(gè)體表現(xiàn)為2 組間雜交。這2個(gè)種群分別位于四川北部的紅原縣和松潘縣，該區(qū)域北側(cè)種群的遺傳組成中含更多的中國(guó)沙棘遺傳成份，南側(cè)種群的遺傳組成中含更多的云南沙棘遺傳成份，因此，推測(cè)該地區(qū)為中國(guó)沙棘和云南沙棘的分布邊界帶。Wang等[8]利用葉綠體片段序列研究中國(guó)沙棘的空間遺傳分布時(shí)，發(fā)現(xiàn)重疊分布區(qū)的中國(guó)沙棘的2個(gè)單倍型也存在于云南沙棘中，并且單倍型在若爾蓋盆地有明顯的分界。這與本研究確定的分布邊界帶區(qū)域相符，這一結(jié)果可為沙棘的物種鑒定分類(lèi)提供初步依據(jù)。要進(jìn)一步確定分界線(xiàn)的地理位置，還需要更多的數(shù)據(jù)，如形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)、地形數(shù)據(jù)、氣候數(shù)據(jù)等。

中國(guó)沙棘和云南沙棘的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，分支支持率低，可能存在種間雜交；同一亞種內(nèi)部各分支支持率大多不高，同一地理種群個(gè)體并不能完全聚在一起，說(shuō)明地理種群間存在基因流；Structure 結(jié)果也表明，亞種間有基因漸滲現(xiàn)象，這與前人研究結(jié)果一致[6,11]。中國(guó)沙棘與云南沙棘親緣關(guān)系較近，亞種間和種群間可能存在基因交流。但要進(jìn)一步明確基因交流的程度，還需要更多的SSR 位點(diǎn)等遺傳信息的支持，以及覆蓋范圍更廣的樣品收集。

3.2 中國(guó)沙棘和云南沙棘的遺傳分化和遺傳多樣性

孫坤等[20]利用ISSR 標(biāo)記研究了不同海拔中國(guó)沙棘的遺傳變異情況，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生遺傳分化的主要原因可能是基因流受限。本研究中，依據(jù)AMOVA和遺傳分化系數(shù)，發(fā)現(xiàn)云南沙棘的遺傳分化程度高于中國(guó)沙棘，造成這一結(jié)果的主要原因可能是云南沙棘采集自四川、云南、西藏等地形復(fù)雜地區(qū)，復(fù)雜的地形和氣候使種群間的基因交流受限。另一個(gè)可能是，某些地區(qū)的云南沙棘種群可能與某種沙棘，如肋果沙棘[2]，存在種間雜交，雜交后代的存在或雜交導(dǎo)致的基因漸滲使得這些種群與其他地區(qū)的云南沙棘種群的遺傳差異升高。

沙棘被推測(cè)為起源于青藏高原地區(qū)，青藏高原的隆升和第三紀(jì)氣候影響了它的分布范圍和多樣性，而后擴(kuò)散到歐洲和中國(guó)其他地區(qū)[11,21]。中國(guó)沙棘在我國(guó)境內(nèi)分布廣，從西藏、云南到遼寧、內(nèi)蒙均有自然種群分布，生境差異較大。通常分布范圍廣的物種有著更高的遺傳多樣性，而遺傳多樣性越高，越能為其適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境提供有力支持[22-24]。本研究中，中國(guó)沙棘的各項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)均高于云南沙棘，代表中國(guó)沙棘的遺傳多樣性高于云南沙棘種群，這與前人研究結(jié)論一致[8,13]，這可能是由于中國(guó)沙棘相較于云南沙棘分布范圍廣。

4 結(jié)論

本研究探討了中國(guó)沙棘和云南沙棘的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，發(fā)現(xiàn)中國(guó)沙棘的遺傳多樣性高于云南沙棘，與前者更廣泛的分布范圍有關(guān)；云南沙棘種群的遺傳分化程度高于中國(guó)沙棘種群，推測(cè)是復(fù)雜的高山地形限制了云南沙棘種群間的基因交流，或區(qū)域性種間雜交漸滲提高了不同地理種群間的差異；確定了中國(guó)沙棘和云南沙棘的分布邊界位于四川北部的紅原縣、松潘縣一帶。本工作為中國(guó)沙棘和云南沙棘遺傳資源的保護(hù)和利用提供了重要的基礎(chǔ)。