薄殼山核桃品種親緣關系分析與指紋圖譜構建

何旭東，鄭紀偉，田雪瑤，教忠意，竇全琴

(江蘇省林業科學研究院，江蘇 南京 211153)

薄殼山核桃（Carya illinoensis(Wangenh.) K.Koch）屬胡桃科（Juglandaceae）山核桃屬（Carya），又稱碧根果、長山核桃、美國山核桃，自然分布于美國和墨西哥北部，為一種多年生高大落葉喬木。現以美國為產業中心，分為東南、中南、西南和北部四大商業化產區，涵蓋全美24個州[1]。薄殼山核桃是典型的果材兼用型樹種。其堅果產量高、殼薄個大、營養豐富，是大眾頗為喜愛的保健食品；種仁含油量高達70%以上，不飽和脂肪酸超97%，優于茶油、花生油等，是世界重要的木本油料植物[1-3]。薄殼山核桃因其世代周期長、樹形優美、樹勢挺拔，也是重要的景觀綠化樹種；其木材結構細密、堅固強韌、紋理美觀，可用于軍工、建筑以及制作高檔家具和工藝品，屬于珍貴用材樹種[1-3]。

我國引種薄殼山核桃已有百年歷史，前期主要引進種子及苗木，后期開始引進系列良種，并進行自主選育與栽培推廣。據不完全統計，近年來江蘇、浙江、安徽、四川、云南等省份陸續引進和保存的薄殼山核桃品種超過100個[4]，相繼審（認）定的良種超過40個，包括美國引進與自主選育的品種[5]。但薄殼山核桃品種選育多利用種子繁殖，后代變異大且童期較長，目前栽培推廣的大多仍是從美國引進的品種。由于薄殼山核桃品種引進均為種條，形態相似難以區分，且前期引種歷史較長、引種程序不規范，各地間相互頻繁引種難免造成品種間相互混雜混淆，甚至直接改換國外品種名稱，造成同物異名或同名異物的現象經常發生，這也給薄殼山核桃品種種質評價、遺傳改良以及面上推廣工作帶來極大的不便。因此，對薄殼山核桃品種進行準確的評價與鑒定，不僅有助于保護林木植物新品種權、保障所有權人的利益，而且能從根本上保證我國薄殼山核桃產業的商業化發展。

分子標記技術不受外界環境及人為因素的影響，可直接反映不同個體間DNA 水平上的差異，實驗過程簡便快捷、結果穩定可靠，已廣泛應用于林木遺傳學及基因組學的各個領域。在薄殼山核桃親緣關系分析與品種鑒定方面，前期已有RAPD[6-8]、ISSR[9]、SRAP[10]、SSR[11-12]、SNP[13]、DNA 條 形碼[14]和葉綠體基因組[15-16]等眾多標記的研究。與顯性標記相比，SSR 標記在基因組中各個區域廣泛分布、數量極大、變異豐富，且為共顯性遺傳，是目前使用最廣泛的一種分子標記[17]，尤其是結合熒光標記高通量基因分型技術，已成功應用于楊樹[18]、柳樹[19]、櫟樹[20]、刺槐[21]、含笑[22]、桂花[23]等多個木本植物指紋圖譜的構建研究。國內薄殼山核桃分子生物學的研究起步較晚，在指紋圖譜構建方面尚未見相關報道。鑒于此，本研究選取薄殼山核桃及其近緣種開發的SSR 標記，經篩選后利用熒光標記并對25個美國引進品種進行基因分型，用以構建指紋圖譜并分析其親緣關系，旨在建立一種快速、穩定、可靠的薄殼山核桃基因分型體系，為薄殼山核桃品種改良工作提供有益參考，同時也為薄殼山核桃遺傳資源的鑒定與品種保護提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與DNA 提取

本研究所用25個薄殼山核桃品種均從美國引進，定植于江蘇省句容市南京林業大學薄殼山核桃種質資源圃內（表1）。采集所有品種幼嫩葉片，利用試劑盒（天根生化科技有限公司，DP305）按說明書步驟提取葉片總DNA。分別使用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測總DNA 的完整性、純度與濃度。

表1 試驗材料Table 1 Experimental materials

1.2 引物篩選與通用性檢測

從前期已發表的薄殼山核桃及其近緣種SSR標記中挑選54 對通用性較高的引物，并隨機選擇16個品種為模板進行引物初篩。經高分辨率瓊脂糖凝膠電泳檢測，最終確定10 對SSR 標記用于后續分析（表2）。用熒光基團標記所有引物前項5′端，交由生物公司進行合成。

表2 10 對SSR 引物信息Table 2 Details of 10 SSR primer pairs

采用10 μL PCR 反應體系進行引物初篩，包含1 μL DNA 模板，各0.4 μL 前后項引物，5 μL PCR Mix（上海生工Taq PCR Mix 預混液，2×，含藍染料），3.2 μL ddH2O。PCR 擴增程序按以下步驟進行：首先94℃預變性4 min；然后94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環35 次；最后72℃延伸10 min。

1.3 基因分型體系建立

基因分型PCR 反應為25 μL 體系，包含1 μL DNA 模板，各1 μL 前后項引物，1 μL dNTP，2.5 μL Taq Buffer（含MgCl2），0.5 μL Taq 酶，18 μL ddH2O。PCR 擴增程序按以下步驟進行：首先95℃預變性3 min；其次94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環10 次；隨后94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環35 次；最終72℃延伸8 min。PCR 產物中加入HiDi 與LIZ 500 內標，經98℃變性5 min 后迅速移至冰上進行冷卻，隨后放置于ABI 3730 XL 全自動DNA 測序儀內進行電泳檢測。

1.4 數據分析

利用測序儀自帶的Genemapper 軟件統計各位點基因分型數據；使用MSA 軟件計算各位點等位基因數（A）和多態信息含量（PIC）等數據；使用NTSYS-pc 軟件中Qualitative data 模塊計算兩兩個體間遺傳相似系數（GS）：GS= 2Nij/（Ni+Nj），式中：Nij為i和j共有的譜帶數，Ni和Nj為i和j個體的譜帶數，以clustering 程序中SHAN 進行非加權組平均法（UPGMA）聚類。

2 結果與分析

2.1 SSR 標記多態性分析

以25個薄殼山核桃品種為模板，檢驗10 對熒光SSR 標記多態性情況。表3 表明 ：10 對SSR標記共擴增出68 條等位片段，平均6.8個，其中，位點BFU-Jr19 擴增的等位基因數最少（3個），位點Cc19 擴增的等位基因數最多（12個）。10個SSR 標記的多態信息含量（PIC）的變化范圍為0.291 0～0.843 5，平均0.588 3，其中，位點Cc19的PIC 值最高，位點BFU-Jr82 的PIC 值最低。圖1為位點PM-CIN4 在部分薄殼山核桃品種中的基因分型結果。

圖1 位點PM-CIN4 在薄殼山核桃部分品種中的基因分型Fig.1 Genotyping by locus PM-CIN4 for partial varieties of Pecan.

表3 10 對SSR 標記多態性檢測Table 3 Polymorphism detection of the 10 pairs of SSR markers

2.2 品種指紋圖譜構建

對10個SSR 位點擴增的等位片段做進一步統計分析，經不同標記間相互組合，最終確認4 對核心引物的組合可用于25個薄殼山核桃品種指紋圖譜的構建。表4 表明：標記Cc19 可以區分11個品種，標記PM-GA31 能區分10個品種，標記PM-CIN4 能區分6個品種。通過引物Cc19、PMGA31 與PM-CIN4 的組合可區分21個薄殼山核桃品種，加入標記PM-GA41 后，4 對引物組合可完全區分薄殼山核桃的25個品種。

表4 25個薄殼山核桃品種的指紋圖譜Table 4 Fingerprint of 25 varieties of Pecan

2.3 聚類分析

計算各品種間遺傳相似系數，并按UPGMA法進行聚類（圖2）。25個薄殼山核桃品種間遺傳相似系數在0.62～0.99 之間，并聚類成2個大的類群。

圖2 25個薄殼山核桃品種的聚類Fig.2 Dendrogram of 25 varieties of Pecan

第一個大的類群包含9個薄殼山核桃品種，其中，‘Schley’自由授粉子代‘Cape Fear’與‘Schley’雜交子代‘Oconee’聚成一個小的分枝，并與品種‘Choctaw’聚在一起，而‘Choctaw’的一個親本‘Mahan’也是‘Schley’實生子代。其他品種如‘Mandan’、‘Nacono’、‘Tejas’和‘Shoshoni’因雜交親本差異較大，各品種間的親緣關系也相對較遠。第二個大的類群包含16個薄殼山核桃品種，其中，來源于實生苗的品種‘Hirschi’與‘Kiowa’親緣關系較近；品種‘Mohawk’、‘Schley’、‘Western’和‘Jackson’聚類成一個小的分枝，其中‘Mohawk’一個親本為‘Mahan’，而‘Mahan’也是‘Schley’實生子代；‘Western’又名‘Western Schley’，雖然來源于實生苗選育，但其性狀與‘Schley’極為相似；而‘Jackson’為雜交選育，其中的一個親本即為‘Schley’。其余幾個品種如‘Navaho’、‘Wichita’和‘Pawnee’雖然親緣關系相對較遠，但追溯其親本來源，均與品種‘Schley’相關。

3 討論

薄殼山核桃為雌雄同株，一般通過控制授粉進行雜交，再收取種子進行子代測定，進而選育新的品種。從表1 可以看出，本研究選取的25個薄殼山核桃品種中，有一半的品種直接與‘Schley’相關，或是通過‘Schley’的子代進一步雜交選育的品種，可見薄殼山核桃品種間的遺傳基礎較狹窄，品種間的形態極為相似，很難通過表型性狀進行準確的鑒定，而基于分子標記技術的指紋圖譜無疑是進行快速鑒定的重要技術手段。同時，基于林木新品種權申請與保護的需要，也可提交分子標記指紋圖譜作為輔助證據[28]。SSR 為共顯性標記，基因分型時能區分純合子與雜合子，且SSR 標記變異程度高，不但能夠區分親緣關系較近的種，甚至能夠鑒定同一個雜交組合中的不同個體，如在核桃中就有過類似報道[29]。此外，如圖1 所示，基于熒光SSR 標記聯合高通量測序儀的基因分型技術，相比傳統的PAGE 膠更加直觀、快速、準確，特別是針對差異較小的等位片段有著更高的分辨率[30]。

SSR 標記廣泛分布于植物基因組的各個區域，通常包含EST-SSR、基因組SSR（genomic SSR）和葉綠體SSR（cpSSR）3種類型。EST-SSR 來源于基因組轉錄區域，其序列相比基因組SSR 更加保守，種間通用性較高但多態性較低[31]。有研究表明：EST-SSR 標記不僅可應用于種間及屬間[32-33]，甚至在亞科間與科間均表現出較高的通用性[34-35]。本研究中有2個EST-SSR 標記（Cc19、Cc14）來源于山核桃（C.cathayensis，胡桃科山核桃屬），3個EST-SSR 標記（BFU-Jr19、BFU-Jr82、Zm26）來源于核桃（Juglans regia，胡桃科核桃屬），可見EST-SSR 標記在同屬不同種間、甚至屬間均表現出較好的通用性用性。此外，Li等[24]的研究也發現：從山核桃中開發的311個標記有63.02%可以用于山核桃屬的其他樹種，如薄殼山核桃、大別山山核桃（C.dabieshanensis）和湖南山核桃（C.hunanensis）等。從核桃中開發的EST-SSR 標記在核桃屬（Juglans）、山核桃屬（Carya）以及喙核桃屬（Annamocarya）不同樹種中通用性均較好[26]。

本研究選取的10個SSR 標記中，有5個標記為基因組SSR 標記（PM-CIN4、PM-GA31、PMGA38、PM-GA41、WGA70），5個為EST-SSR 標記（Cc19、Cc4、BFU-Jr19、BFU-Jr82、Zm26）。從表3 中PIC 數據可以看出，盡管EST-SSR 標記Cc19 的值最大，但總體而言，基因組SSR 標記的多態性相比較于EST-SSR 標記要高。通常認為，高度多態位點的PIC 值一般大于0.5，中度多態位點的PIC 值一般在0.25～0.5 之間，低度多態位點的PIC 值一般小于0.25[36]。本研究中，有6個標記PIC 值大于0.5，4個標記PIC 值在0.25～0.50之間，總體標記的多態性較高。

聚類分析中，25個薄殼山核桃品種聚成了2個大的分枝，各個品種之間的聚類與遺傳背景之間沒有明顯的對應關系。雖然一些品種從遺傳背景看，親緣關系應該較近，如‘Forkert’和‘Jackson’均為‘Success’與‘Schley’的雜交子代，‘Choctaw’與‘Mohawk’均為‘Success’與‘Mahan’的雜交子代，但聚類時并沒有聚在一起。又如‘Cape Fear’、‘Mahan’與‘Sumner’，均為‘Schley’子代，盡管只有一個親本不一樣，但彼此間的親緣關系相差較遠。類似的情況在Conner等[6]以及Grauke等[11]的研究中也有過報道。推測可能是由于薄殼山核桃為多年生高大喬木，世代周期較長，遺傳背景復雜且高度雜合，雜交子代遺傳分化較嚴重造成的。此外，標記的數量、類型以及不同的聚類方法均會對聚類結果產生一定的影響。因此，在后期的研究中，一方面要加入各個品種的雜交親本，另一方面要挑選覆蓋全基因組范圍、一定數量、效率更高的標記，才能最大程度揭示薄殼山核桃品種間親緣關系的真實水平。

4 結論

薄殼山核桃品種間遺傳基礎較為狹窄，外觀形態極為相似，僅從表型性狀難以進行準確區分。本研究基于熒光SSR 標記開展了25個美國薄殼山核桃品種親緣關系分析與指紋圖譜構建研究，篩選出的10 對SSR 引物多態性較高，建立的基因分型體系穩定且可靠，可為薄殼山核桃種質鑒定及品種保護提供有效方法，也可為薄殼山核桃遺傳資源的引進及雜交育種親本的選配提供科學依據。