miRNA-612表達水平對宮頸癌細胞增殖的影響

廉 靜，張露文，陳勃同

(1.哈爾濱醫科大學附屬第四醫院 醫務科，黑龍江 哈爾濱150001；2.澳門科技大學；3.東北農業大學)

宮頸癌是常見的婦科腫瘤之一，盡管手術、放療、化療和放化療聯合等先進治療手段提高了總體生存率，但是因為耐藥和復發等因素，晚期或者發生遠處轉移的宮頸癌病人預后較差，5年生存率較低[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類小的(長度為19-25個核苷酸)不具有編碼功能的非編碼RNA分子，通過結合靶基因的mRNA的3′-UTR(非編碼區)來參與基因表達及功能的調控[2]。國內外研究表明，miRNA在多種生物學過程中發揮不可替代的調節作用，例如發育、DNA損傷修復和分化、細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移等。此外，miRNA失調與癌癥和其他人類疾病的發生有關，其作為癌基因或腫瘤抑制因子參與各種癌癥(包括宮頸癌)的病理生理過程[3]。本實驗分別檢測了3種不同類型宮頸組織中miR-612的水平，并研究了HeLa 細胞中miR-612表達變化時相應的細胞增殖率變化趨勢，以期加深對miR-612在宮頸癌中的認識。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HeLa(人宮頸癌細胞)購自武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司；miRNA-612 mimics(miRNA-612模擬物)以及與其匹配的陰性對照(NC)購自上海吉凱基因醫學科技股份有限公司 ； DMEM培養基購自美國 Gibco 公司；胰酶細胞消化液(0.25%胰酶)和Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；胎牛血清購自四季青生物科技有限公司；Trizol 購自美國Invitrogen 公司 ；將總RNA逆轉錄成cDNA所用的試劑盒購自上海東洋紡(TOYOBO)生物科技有限公司；SYBR Green試劑盒購自美國Roche公司；RT-PCR實驗中涉及到的U6和miR-612 mRNA的引物序列均由北京睿博興科生物技術有限公司設計并合成。

1.2 組織標本

選取并收集130例2019年1月—2021年3月就診于哈爾濱醫科大學附屬第四醫院的宮頸癌患者經手術切除的宮頸癌組織以及癌旁組織。收集120例經病理學檢測正常的宮頸組織。所有患者平均年齡50.62±6.29歲，排除術前接受放療、化療或其他接受抗癌治療的患者。收集的所有組織標本均于手術取出后立即保存在液氮中，并轉移至-80℃冰箱保存，待進一步檢測。本研究經過醫院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.3 細胞培養和轉染

在37℃、5%二氧化碳濃度的環境中，用DMEM 培養基培養 HeLa 細胞，DMEM中添加10%的優質胎牛血清以及青霉素-鏈霉素溶液。應用 Lipofectamine法將miR-NC和miRNA-612 mimics 轉染到miR-NC組和miR-612 mimics組細胞中，僅添加轉染試劑組為正常對照組。轉染6 h后，將細胞消化每組設5個復孔，培養48 h 后，方可進行接下來的相關檢測。

1.4 RT- PCR 檢測 miRNA-612 mRNA 表達

取不同組織標本和3組HeLa細胞，用TRIzol法提取總RNA，并檢測RNA 濃度和純度，根據逆轉錄試劑盒說明，將提取的總RNA 逆轉錄成cDNA,根據SYBR Green 試劑說明書，制備 10 μl反應體系進行擴增。U6作為內參對照， miRNA-612 mRNA的相對表達水平采用 2-△△Ct法進行計算。

1.5 CCK-8 法檢測細胞增殖情況

待轉染完成后，收集并用DMEM重懸細胞，分別將3組細胞懸液接種于96孔板中，每組設置5個復孔，每孔加入100 μl DMEM，含有細胞數量為5×103個，在第0 h、12 h、24 h、 36 h和48 h分別向相應的培養孔中加入CCK-8試劑10 μl，37℃條件繼續孵育3.5 h,酶標儀測定630 nm 處相應的吸光值，計算細胞增殖率。

1.6 統計分析

2 結果

2.1 miRNA-612在3種組織中的表達

宮頸癌組織中miRNA-612的相對表達低于正常宮頸組織和宮頸癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05) ，提示miRNA-612 在宮頸癌組織中低表達；正常宮頸組織和宮頸癌旁組織中miRNA-612的相對表達水平無明顯差異(P>0.05)。 見表1。

表1 組織標本中miRNA-612的表達水平

2.2 miRNA-612在3組細胞中的表達

miR-612 mimics組中的miRNA-612的相對表達水平明顯高于其在正常對照組和 miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)，提示轉染成功，且miRNA-612在細胞中成功高表達；miRNA-612在正常對照組和 miR-NC組中的表達水平相近，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 miRNA-612在3組細胞中的表達水平

2.3 3組細胞的增殖情況

與正常對照組和 miR-NC組相比，miR-612 mimics組細胞增殖率減低，差異明顯，具有統計學意義(P<0.05)，即在HeLa 細胞中過表達miR-612后，可以抑制HeLa 細胞的增殖；而正常對照組和 miR-NC組細胞增殖率相比，差異不明顯(P>0.05)。見表3。

表3 3組細胞的增殖率(%)

3 討論

大量研究發現，miRNA是多種疾病發病機制的關鍵調節者，也是一類有前景的治療靶點[4]。隨著多種miRNA被發現，癌癥的分子機制和診療策略得到了更深入的發掘，其在癌癥中的作用越來越受到關注[5]。

近年來，宮頸癌的發病率和死亡率均呈現顯著下降趨勢，但是在一些發展中國家還是持續在較高水平[6]。因此，完善宮頸癌的發病機制，探尋與診斷、治療和預后相關的生物學標志物已成為研究工作的重點。有證據表明，宮頸癌組織中許多miRNA的表達發生變化，在宮頸癌的發生、發展和轉移中發揮著至關重要的作用[7]。進一步探究miRNA在宮頸癌中的調控功能及其可能的分子機制可能有助于確定診斷標志物和治療靶點。有研究顯示，MiR-612在肝癌中負調控肝癌侵襲性瘤體形成、基質降解、上皮間質轉化和轉移[8]，此外，MiR-612在子宮內膜癌、卵巢癌、膀胱癌、結腸癌、胃癌、黑色素瘤中也被不同程度的下調，暗示其發揮潛在的抑制腫瘤的作用[9]。但是，miR-612在宮頸癌中的表達情況以及發揮的相關作用還沒有確切的報道。

本研究分別檢測了3種不同宮頸類型組織中miR-612的水平并進行比較，確定了miR-612與宮頸癌相關。此外，培養HeLa細胞，并通過轉染使miR-612在細胞中過表達，與未經處理的HeLa細胞以及轉染對照的HeLa細胞進行比較。組織標本檢測結果表明，與正常宮頸組織和宮頸癌旁組織相比，miR-612在宮頸癌組織中呈現出低表達趨勢。體外功能實驗表明，過表達miR-612后的HeLa細胞與未經處理的HeLa細胞以及轉染對照的HeLa細胞相比增殖率明顯減低，說明miR-612可抑制HeLa細胞的增殖。

綜上，miR-612在宮頸癌中表達減低， miR-612在體外抑制宮頸癌細胞增殖，這表明miR-612可能對宮頸癌具有抗癌作用，很有可能在未來的宮頸癌診斷、治療管理中發揮重要作用，然而其明確的臨床意義還需要進行大量研究加以論證。