竹紅菌素的研究進展

徐 倩，任清褒，張 燕，夏更壽*

（1.麗水學院生態學院,浙江麗水323000;2.麗水學院工學院,浙江麗水323000）

竹紅菌素（Hypocrellin）是肉座菌科的竹紅菌和竹黃菌等少數幾種竹寄生菌的次生代謝產物，屬于苝醌類衍生物，目前主要來源是通過菌絲體內次級代謝合成途徑產生。作為苝醌類化合物，其結構賦予它一定的光動力活性，表現出較好的光療作用。因此近年來研究熱點大多集中在光敏殺傷腫瘤細胞和抑制病毒等醫學領域，以及光活化農藥、光電轉換材料等的開發利用方面。本文綜述了竹紅菌素的最新研究進展，重點闡述了竹紅菌素在生物合成途徑、應用、產量優化等方面的進展情況。

1 竹紅菌素主要天然來源

竹紅菌素是由萬象義等人[1]在1980年首次從藥用真菌竹紅菌的肉質子實體中分離出來的新苝醌類化合物，因源自竹紅菌而得名。而后在1991年，Kishi等人從另一個藥用真菌竹黃菌中也分離得到竹紅菌素[2]。

竹紅菌和竹黃菌等少數幾種竹寄生菌是竹紅菌素的天然來源。其中竹黃菌（Shiraia bambusicolaP.Hennings）主要分布在中國浙江、江蘇、安徽等省份，在日本、斯里蘭卡也有分布。浙江省內的11個地級市均有分布，在天目山、莫干山、天臺山、四明山、百山祖等主要山脈都有發現，其中以杭州、湖州、麗水等地區的分布較廣，產量也較大[3]。它是我國傳統的重要藥用真菌，屬于囊菌亞門（Ascomycotina）肉座菌科（Hypocreaceae）竹黃屬（Sharaia），主要在苦竹、短穗竹、雷竹、白紋短穗竹等竹類植物的細嫩枝干上寄生，以短穗竹最為普遍，寄生率最高，產量最大，且只特異地寄生在前一年生的枝條上[4-5]。竹黃菌子座成熟時偏黃，表面光滑，紅色物質逐漸積累呈粉紅色，質地松軟，多為紡錘形或不規則瘤狀、塊狀，表面有細密紋理及針尖大小的斑點[6]。通常以肉質子座入藥，其中竹紅菌素類成分的含量是衡量竹黃藥材質量的重要指標，近年通過代謝組學技術檢測出其他一些具有重要藥理作用的物質，例如黃酮類、香豆素類及肉桂酸類等[7-8]。內源性真菌Penicillium chrysogenum、Phaeosphaeriasp等經發酵分離也可得到竹紅菌素、痂囊腔素等苝醌類化合物[9-10]。因此，竹紅菌素主要來自于寄生菌，同時也是寄生菌藥用價值的主要成分之一。

2 竹紅菌素的結構、合成途徑與調控

苝醌類化合物是一類分布在自然界生物中的光敏色素。苝醌類衍生物（Perylenequinonoid derivatives，PQDs）是以苝醌為母核的化合物，含有5個共軛生色環，顏色較深，包括竹紅菌素（Hypocrellins）、尾孢素（Cercosporin）、痂囊腔菌素（Elsinochromes）、弗萊菌素（Phleichrome）和金絲桃素（Hypericin）等一系列的化合物[11]。竹紅菌素則是多種苝醌類衍生物的混合物，主要包括竹紅菌甲素（Hypocrellin A，HA）、竹紅菌乙素（Hypocrellin B，HB）、竹紅菌丙素（Hypocrellin C，HC）、竹紅菌丁素（Hypocrellin D，HD），在天然竹紅菌素中竹紅菌甲素含量為95%，遠大于竹紅菌乙素，在合適的條件下兩者可以相互轉化。

竹紅菌素的生物合成途徑仍不十分明確，目前認為主要是通過聚酮類化合物途徑合成，途徑中相關基因也陸續被詳細注釋[12]。Zhao等人對比竹紅菌素產量高的野生型S4201-W和產量低的突變體S4201-D1兩個竹黃菌的轉錄組數據發現，有716個Unigenes在突變體中表現為上調，同時有188個基因表現出下調，其中有7個基因參與了HA的生物合成，包括多銅氧化酶（Multicopper oxidase）、成束蛋白（Fasciclin）、聚酮合成酶（Polyketide synthase）、甲基轉移酶/FAD依賴性單加氧酶（O-methyltransferase/FAD-dependent monooxygenase）、甲基轉移酶（O-methyltransferase）、羥化酶（Hydroxylase）和FAD/FMN依 賴 氧 化 還 原 酶（FAD/FMN-dependent oxidoreductase），并初步推斷HA可能的生物合成途徑及關鍵基因[13]。另外，一些真菌全局性的調控因子、轉運蛋白等也參與次生代謝產物HA的生物合成，如光依賴型調節因子veA[14]、轉運蛋白（MFS）[15]等。

對竹紅菌素生物合成途徑相關基因的功能驗證研究也已陸續開展。在分別敲除編碼聚酮合成酶（PSK）、單加氧化酶（MONO）、轉錄因子（ZFTF）基因的CRISPR轉基因菌株中竹紅菌素合成明顯受到抑制，合成相關基因的表達量都顯著降低，初步驗證了這3個基因表達水平與竹紅菌素合成呈正相關關系。在過表達多銅氧化酶基因（MCO）的菌株中，竹紅菌素合成的多個基因表達量上升，竹紅菌素產量相比于野生型提高了5倍[16]。從分子水平解析竹紅菌素生物合成途徑，可以更深入地了解竹紅菌素，并為后續生物合成與調控的分子機理研究提供重要的參考，也為合理地利用竹黃等真菌資源提供新的途徑。

3 光敏的作用機制與應用

光敏劑能在光和氧氣的作用下產生活性氧(ROS），活性氧有較強的氧化能力，在細胞中攻擊一些生物大分子如DNA、蛋白質、脂類等，引起一系列細胞內生理生化的變化，如細胞膜的劣變、細胞骨架損傷、阻斷細胞正常的周期等，因而對細胞具有明顯的殺傷作用。光敏活性的主要機理有兩種:分別是type I和typeⅡ機制，其中typeⅠ機制主要發生在無氧環境下，經電子傳遞產生的活性氧主要有超氧陰離子自由基（O2）和羥基自由基（·OH）；typeⅡ機制主要發生在有氧條件下，通過產生單線態氧（1O2）與生物大分子物質結合[17-18]。

竹紅菌素是一種新型的光療光敏劑，其藥用價值主要表現在抗炎、鎮痛、抗菌、抗腫瘤等方面，民間常用于治療中風、小兒驚風、虛寒胃痛、風濕性關節炎、跌打損傷、氣管炎和某些皮膚病等疾病[19-20]。萬象義等人將竹紅菌甲素用于治療外陰白色病變和疤痕疙瘩并取得了較好的療效[1]，臨床應用上已用來治療皮膚病。隨著研究的深入，發現竹紅菌素還具有良好的光敏殺傷腫瘤細胞、抑制艾滋病病毒HIV-1等作用[21]。竹紅菌素與抗腫瘤藥物血卟啉衍生物相比，具有一定的優勢，如易純化、光化學動力高、從正常組織排除的速度快等[22]。HA和HB能通過光動力學作用，產生血管生成抑制因子促進人腦瘤細胞死亡[23]。HA能在光照下通過產生羥自由基損傷受體的DNA，促使其裂解，在無光照條件下HA也能誘導人黑色素腫瘤細胞（A375-S2）凋亡，同時誘導細胞周期蛋白CylinB1 mRNA表達增加并使細胞周期停滯在S期，其化學結構可能是誘導細胞凋亡的決定因素[24-25]。此外，藥理實驗顯示竹紅菌素具有鎮痛、抗炎和抗菌等作用，但竹紅菌素是脂溶性物質，其低水溶性和無特異組織分布制約了HA在光動力療法中的應用，可采用物理包埋方式或化學修飾等方法進行改良，如用脂質體或環糊精等包埋劑包埋，提高其水溶性[26]。采用化學修飾的方式將其裝載在轉鐵蛋白修飾的聚乳酸-羥基乙酸和羧甲基殼聚糖靶向納米粒中（HA-CMC-PLGA NPs），飼喂老鼠，結果顯示飼喂處理組小鼠的腸道和腫瘤部位積累了HA-CMC-PLGA NPs，同時腫瘤生長抑制率達到了63%[27]。采取上述的改良方式，不但提高了HA的利用效率，同時也使藥物開發更有靶向性。

除上述應用在醫學領域外，竹紅菌素還可應用在農業、食品等領域。利用其光反應可開發新型、綠色、環保的光活化農藥應用于農業生產中。徐德欽和夏更壽的研究表明，3種不同有機試劑的竹黃菌提取物對農作物中常見的病原菌均有不同程度的抑制作用，其中甲醇提取物的效果最好，對棉花枯萎病菌的抑制率可達74.78%，這可能與甲醇提取菌絲體中竹紅菌素的效率有關[28]。殷紅福等人[29]也有類似的研究結果，他們發現竹紅菌甲素能明顯的抑制多種植物病原菌，尤其是對松針褐斑、鐮刀菌、蘋果腐爛病菌、山核桃干腐病原菌等抑制率高達90%以上。此外，竹紅菌甲素對眾多的害蟲（如桃蚜與黃粉蟲等）均有殺滅效果。在光照條件下，HA對番茄灰霉菌的抑制作用顯著高于黑暗條件，通過光反應typeⅠ和typeⅡ的機制起到抑菌的作用，其中typeⅡ為主要類型，產生的活性氧中單線態氧發揮的作用最大，是HA在抑制番茄灰霉菌菌絲生長的最關鍵因子[30]。另外，竹紅菌素的著色力強、可溶于酒精和其他有機溶劑，色澤鮮紅且富有保健功能，可作為一種脂溶性食品添加劑(食用色素）應用到食品加工業中。由此可見，竹紅菌素在醫藥、農業、食品等領域有著巨大的研究價值和潛在開發應用價值。

4 產量優化方式

目前竹紅菌素的天然產量較低，大量獲得的生產方法主要有天然萃取法、化學合成法和微生物發酵法。其中萃取法生產因生物資源有限，生產周期過于漫長，無法滿足研究和生產的需要；化學方法合成成本高，步驟較煩瑣，同時會殘留一些非目標的化學物質，純度受到影響，無法實現大規模生產；而微生物發酵生產是目前公認的、比較容易實現大規模生產的一種方法[31-32]。

在進行微生物發酵HA生產前，篩選出合適的株系是首要考慮的因素。各個菌株間存在明顯的遺傳分化，來源不同、產地不同的竹黃菌株在形態以及竹紅菌素產量方面存在著較大的差異[33]。本研究團隊曾從野生竹黃子實體中分離得到82株內生真菌，發酵產物經TLC、HPLC鑒定獲得能生產竹紅菌素的ZHLS-03，并通過分子鑒定該菌株為竹黃菌[34]。Liang等人從短穗竹（B.densiflorum）中分離得到兩個菌株，在竹紅菌素產量上差異較大[35]。不同的菌株株系產生HA的效率不同，發現或創造新的菌株是提高HA產量的途徑之一。從竹黃子座中新分離出未知菌絲可通過多次分離和轉代進行培養，依據菌絲的形態、顏色初步進行判斷，進一步對真菌內轉錄間隔區（ITS）進行擴增和測序，與已知菌株序列進行比對來確定新菌株的種屬地位[36]。如從蛇足石杉（Huperzia serrata）中分離得到一株可產生石杉堿甲的內生真菌，屬于竹黃菌屬，被命名為Shiraiasp.Slf14，其菌絲和分生孢子形態與Shiraiasp.SUPER-H168相似，分子生物學分析結果 表 明Shiraiasp.Slf14與S.bambusicola、Shiraiasp.SUPER-H168的親緣關系較遠，極可能是為竹黃屬的一個潛在新種[37-38]。新種質的發現可以豐富竹紅菌素的來源，為其生產提供更多的天然資源和選擇。

適宜的培養基質是提高竹紅菌素的產量的重要因素之一。于建興等利用單因素實驗比較不同培養條件對竹黃菌生長和竹紅菌素產量的影響，獲得了最優的發酵條件，并發現竹紅菌素的產生和竹黃菌的生長量有一定相關性，且碳氮比對竹紅菌素的影響較為顯著[39]。在液態發酵培養基中添加不同的金屬離子會影響真菌Shiraiasp.Slf14株系合成苝醌類物質的數量，包括竹紅菌素、痂囊腔菌素等，K+、Na+、Ca2+等離子的添加對合成有促進作用，然而Cu2+、Zn2+、Fe3+離子則極顯著地抑制苝醌類物質的合成。鈣離子通過誘導鈣信號途徑中3個關鍵鈣感應蛋白和苝醌類化合物合成關鍵基因（PKS1、omef、hyd）的轉錄水平來調控苝醌類物質的合成[40]。Shiraiasp.SUPER-H168菌株在固體培養的不同時期外源添加淀粉酶和糖化酶可增加色素產量，進一步分離到24個淀粉酶，并且在不同碳源培養基下表達各異，同時過表達其中的amy365-1和amy130菌株在液體發酵第13天時色素最高產量達到71.85 mg·gds-1，是野生型的2.83倍[41]。在工廠化發酵中選擇培養基的考慮因素除了產量外，還需考慮成本，在所獲得的苝醌類物質產量相近的前提下，則可選擇廉價碳源，為低成本規模化生產奠定基礎[42-43]。

優化液體發酵過程中的溫度、搖床轉速、初始pH值、培養基等條件，可以提高竹黃菌的生物量，正如本團隊的前期研究結果表明，在pH值為7.0、溫度為30℃的發酵條件下竹黃菌絲生長較好且自由基清除率提高[43]。合適的條件下HA的產量也相應地提高，在優化竹黃ZH4菌株液體發酵條件后，HA產量從原來的103.51 mg/L提高到365.14 mg/L，增加了2.52倍，并且在暗培養下產生的色素量最大[43]。也有研究表明，弱光環境（小于600 lx）培養的竹黃菌無論是菌絲內還是胞外的HA都高于黑暗處理中[44]。光照尤其是藍光下可以促進竹黃菌次生菌絲的生長，但色素的產量會減少。超聲處理也影響竹黃菌的生長和生產HA的量，孫春曉對超聲參數進行篩選并確定了最佳的超聲處理條件，即在菌絲培養的第3天進行超聲處理，處理3次，每次5 min，每次間隔12 h，不僅菌絲內HA的含量明顯提高，同時也促進了HA向胞外的分泌，總含量達到247.67 mg/L，是對照組的3倍，另外大量活性氧積累，HA合成與釋放相關基因（包括PKS、Mono、FAD、O-mef和MFS）表達水平上調[44]。外界不同因素影響著微生物發酵方式中竹紅菌素的產量，從本質上來說是影響了真菌的生長狀態，其中涉及到了不同酶的活性、不同基因的表達等調控的網絡，相應的機理還有待于更系統性的研究。

5 結論與展望

綜上所述，目前的竹紅菌素大多是從竹黃中提取的，而我國的野生竹黃資源產量有限，野生竹黃采收期僅集中于每年的4—5月，隨著竹紅菌素的功能開發，天然的竹紅菌素產量遠遠無法滿足市場需求，因此竹紅菌素的大量生產還須通過發酵的方式。在發酵過程中，菌株株系的選擇、培養液的配方、培養條件等都會影響產量。隨著分子生物學研究的發展和發酵技術的提高，更多的研究已深入到生物合成竹紅菌素的機理機制、創新菌株的種質資源、提高利用率等方面并取得了一定的進展，但是仍有一些問題有待于解決和突破。在竹紅菌素生物合成途徑中的大多數關鍵酶和相應的基因敲除株系已經鑒定，但整個代謝通路仍不十分明確，并且其合成也必然受到其他通路的基因或者轉錄因子的影響進而形成一個復雜的代謝調控網絡，另外對環境條件的響應和誘導機制也仍需進一步地研究。這些問題的闡明將使竹紅菌素的生產更加地高效，將為實現竹紅菌素的大規模工業化生產提供堅實的理論依據和技術支撐，也為合理保護、開發利用這一獨特的醫藥資源提供新的方式和途徑。