當歸四逆加吳茱萸生姜湯對不孕癥模型大鼠高遷移率族蛋白B1、自噬蛋白Beclin-1、免疫球蛋白G及炎癥因子的影響※

丁凱雯 顏培正 張 敏

[山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(山東省千佛山醫(yī)院)產(chǎn)科，山東 濟南 250014]

近年來，不孕癥發(fā)病率呈現(xiàn)出不斷上升趨勢，但其發(fā)病原因仍不明確。有研究認為[1-2]，不孕癥的發(fā)生可能與體內(nèi)炎癥因子變化及免疫學(xué)因素相關(guān)。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)屬于非組蛋白，其含量豐富且高度保守。近年來研究顯示，HMGB1可調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)過程，通過調(diào)控細胞內(nèi)多種免疫因子的變化影響不孕癥的發(fā)展[3-4]。本實驗通過觀察當歸四逆加吳茱萸生姜湯對不孕癥模型大鼠免疫HMGB1及自噬蛋白Beclin-1的表達及血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1(IL-1)、干擾素γ(IFN-γ)、免疫球蛋白G(IgG)的調(diào)控作用，探討當歸四逆加吳茱萸生姜湯治療不孕癥的基本機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雌性Wistar大鼠60只，3月齡，體質(zhì)量(180±20)g，由濟南大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(魯)2019-0001。自由進食、飲水，室溫(23±2)℃，相對濕度60%。

1.2 實驗藥物及試劑 當歸四逆加吳茱萸生姜湯藥物組成：當歸45 g，桂枝45 g，白芍45 g，細辛25 g，通草30 g，吳茱萸140 g，生姜125 g，大棗25枚，炙甘草30 g。置于涼水中浸泡2 h，蒸煮30 min后濃縮至濃度為0.5 g/mL的藥液。丙酸睪酮注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司，國藥準字H12020532)；枸櫞酸氯米芬片(Medochemie Ltd.，進口藥品注冊證號H20140688)；TNF-α酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒(批號：K1052-100)、IL-1 ELISA檢測試劑盒(批號：BEK-2309-1P)、IFN-γELISA檢測試劑盒(批號：BEK-2119-1P)、IgGELISA檢測試劑盒(批號：BEK-2104-2P)，均購自武漢艾美捷科技公司；兔抗大鼠HMGB1抗體(批號：H00003141-M)、兔抗大鼠自噬蛋白Beclin-1抗體(批號：R-141-100)、辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體(批號：A470012)，均購自北京博爾西科技有限公司；20%烏拉坦溶液(3 mL/kg)(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；4%多聚甲醛溶液(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 將60只Wistar大鼠按照隨機數(shù)字表法分為4組，空白組、模型組、枸櫞酸氯米芬片組、當歸四逆加吳茱萸生姜湯組，每組各15只。

1.3.2 造模 除空白組大鼠外，其余3組大鼠均參照文獻[5-6]制備不孕癥大鼠模型：大鼠頸背部皮下注射丙酸睪酮注射液0.2 mL，隔日1次，連續(xù)注射7 d。末次注射后,用無菌棉簽擦取大鼠陰道脫落細胞，觀察是否出現(xiàn)角化上皮細胞，持續(xù)出現(xiàn)5 d即提示不孕癥大鼠造模成功，剔除造模失敗大鼠。

1.3.3 給藥治療 造模結(jié)束后第2天開始灌胃給藥，枸櫞酸氯米芬片組予枸櫞酸氯米芬片溶液治療，按人鼠比例換算制備成0.83 mg/mL溶液，按照0.83 mg/100 g灌胃治療，每次2 mL,每日1次。當歸四逆加吳茱萸生姜湯組予當歸四逆加吳茱萸生姜湯濃縮藥液灌胃，濃度0.5 g/mL，每次2 mL，每日2次。空白組、模型組予0.9%氯化鈉注射液，每次2 mL，每日1次灌胃。各組大鼠均連續(xù)灌胃治療15 d。

1.4 標本采集及檢測

1.4.1 大鼠子宮組織觀察 末次給藥24 h后，予20%烏拉坦溶液7.5 mL/kg麻醉并處死大鼠，取血后剖取各組大鼠子宮，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，200倍顯微鏡下觀察大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)變化，Digimizer(醫(yī)學(xué)圖像分析軟件)4.5.2測量子宮內(nèi)膜厚度。

1.4.2 大鼠血清IgG及炎癥因子測定 處死大鼠后，取大鼠靜脈血10 mL置于離心機中做離心處理，離心半徑10 cm，轉(zhuǎn)速3000 r/min，離心10 min，取上清液，ELISA法檢測并記錄各組大鼠血清TNF-α、IL-1、IFN-γ、IgG含量。

1.4.3 HMGB1及自噬蛋白Beclin-1蛋白表達測定 應(yīng)用免疫印跡法(Western Blot)檢測。大鼠處死后，取大鼠子宮內(nèi)膜組織0.5 cm×0.5 cm，將子宮內(nèi)膜組織按照每10 mg組織加入裂解液250 μL，冰上放置10 min，樣品裂解后，13 000 r/min，離心10 min，取上清，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠，確定上樣量后凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜。加入兔抗大鼠HMGB1抗體、兔抗大鼠自噬蛋白Beclin-1抗體一抗在4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次后加入含辣根過氧化物酶綴合的羊抗兔抗體二抗室溫孵育1 h。洗膜后浸泡于ECL顯色液中進行曝光、顯影并定影。Quantity One軟件分析各組大鼠HMGB1及自噬蛋白Beclin-1蛋白灰度值表達水平，用目標蛋白與對應(yīng)的內(nèi)參(β-Actin)的比值，得出目標蛋白的表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮組織形態(tài)變化 空白組大鼠子宮組織細胞排列整齊，厚度均勻，間質(zhì)正常，無(少)炎性浸潤；模型組大鼠子宮組織間質(zhì)水腫疏松，腺體稀少，細胞排列錯亂；枸櫞酸氯米芬片組大鼠炎癥細胞減少，細胞水腫減少；當歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠炎癥細胞減少，細胞排列整齊。見圖1。

圖1 各組大鼠子宮組織形態(tài)變化(HE，×200)

2.2 各組大鼠子宮內(nèi)膜厚度比較 見表1。

表1 各組大鼠子宮內(nèi)膜厚度比較

由表1可見，模型組大鼠子宮內(nèi)膜厚度低于空白組(P<0.05)；枸櫞酸氯米芬片組、當歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠子宮內(nèi)膜厚度均高于模型組(P<0.05)；當歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠子宮內(nèi)膜厚度高于枸櫞酸氯米芬片組(P<0.05)。

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1、IFN-γ及IgG含量比較 見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1、IFN-γ及IgG含量比較

由表2可見，模型組大鼠TNF-α、IL-1、IFN-γ及IgG含量均高于空白組(P<0.05)，枸櫞酸氯米芬片組、當歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠TNF-α、IL-1、IFN-γ及IgG含量均低于模型組(P<0.05)，當歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠TNF-α、IL-1、IFN-γ及IgG含量低于枸櫞酸氯米芬片組(P<0.05)。

2.4 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達比較 見表3。

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達比較

由表3可見，模型組大鼠HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達高于空白組(P<0.05)，枸櫞酸氯米芬片組、當歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達均低于模型組(P<0.05)，當歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達低于枸櫞酸氯米芬片組(P<0.05)。各組大鼠子宮內(nèi)膜組織中HMGB1 、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達見圖2。

A空白組；B模型組；C枸櫞酸氯米芬片組；D當歸四逆加吳茱萸生姜湯組

3 討論

不孕癥發(fā)病機制復(fù)雜，除排卵障礙、精液異常、輸卵管異常外，炎性反應(yīng)、免疫抑制因素也能導(dǎo)致不孕發(fā)生[7-8]。有研究認為，免疫抗體的陽性表達增強，對于免疫性不孕癥有重要影響[9]。不孕癥發(fā)生時，組織內(nèi)炎性因子的種類和比例發(fā)生變化，機體在免疫作用機制下出現(xiàn)免疫異常表達[10]。臨床中炎癥因子TNF-α、IL-1、IFN-γ及免疫因子IgG在免疫性不孕癥患者中普遍呈現(xiàn)升高狀態(tài)，且對疾病的發(fā)展轉(zhuǎn)歸呈現(xiàn)一定程度的表達變化。TNF-α、IL-1、IFN-γ、IgG等能通過調(diào)控多種細胞信號通路來釋放多種免疫抗體，從而達到干預(yù)組織炎性反應(yīng)的效果，是機體進行特異性反應(yīng)的重要因子[11-12]。HMGB1是一種高度保守的核蛋白，具有十分強大的TATA盒(真核生物啟動子的元件之一)啟動子，可對基因轉(zhuǎn)錄的選擇發(fā)揮重要作用，進一步影響細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、重組和基因組穩(wěn)定性[13]。HMGB1除核功能外，還可作為細胞外信號分子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、炎癥、自噬過程[14]。組織內(nèi)發(fā)生炎性反應(yīng)時，巨噬細胞在炎癥因子刺激下能夠釋放大量HMGB1，而HMGB1又負反饋通過靶向抑制因子表達來調(diào)控炎癥因子釋放，減弱免疫因素誘導(dǎo)的不孕癥過程[15]。自噬蛋白Beclin-1在體內(nèi)能特異性調(diào)節(jié)組織中自由基活動程度，對機體的炎性反應(yīng)和炎癥過程發(fā)揮重要作用[16]。自噬蛋白Beclin-1蛋白在胞內(nèi)能與HMGB1蛋白特異性結(jié)合阻斷多種炎性因子表達，進而抑制炎性反應(yīng)過程[17-18]。

中醫(yī)學(xué)認為，素體血虛、內(nèi)有久寒是導(dǎo)致不孕癥發(fā)生的重要原因。《傅青主女科》謂 “寒冰之地， 不生草木；重陰之淵，不長魚龍。今胞胎既寒，何能受孕”[19]。《滇南本草》亦指出“治婦人經(jīng)行受寒， 月經(jīng)不調(diào)……不能受胎”。因此，治療不孕癥應(yīng)以養(yǎng)血通絡(luò)、散寒降逆為主。當歸四逆加吳茱萸生姜湯出自張仲景《傷寒論》，由當歸四逆湯合吳茱萸、生姜組成。方中當歸補血活血，桂枝溫經(jīng)散寒通脈，2味為君藥；白芍助當歸和營補血，以治血虛，細辛、通草助陽散寒，3味為臣藥；吳茱萸、生姜溫中散寒，降逆和胃，助君臣活血散寒之力，共為佐藥；大棗、炙甘草益氣健脾養(yǎng)血，調(diào)和藥性，共為使藥。全方共奏養(yǎng)血通絡(luò)、散寒降逆功效。

本研究結(jié)果顯示，空白組大鼠子宮組織細胞排列整齊，厚度均勻，間質(zhì)正常，無(少)炎性浸潤；模型組大鼠子宮組織間質(zhì)水腫疏松，腺體稀少，細胞排列錯亂；經(jīng)藥物治療后，枸櫞酸氯米芬片組大鼠炎癥細胞減少，細胞水腫減少；當歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠炎癥細胞減少，細胞排列整齊，提示當歸四逆加吳茱萸生姜湯對不孕癥大鼠，子宮組織形態(tài)學(xué)具有明顯改善作用。模型組大鼠子宮內(nèi)膜厚度低于空白組(P<0.05)，枸櫞酸氯米芬片組、當歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠子宮內(nèi)膜厚度均高于模型組(P<0.05)，當歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠子宮內(nèi)膜厚度高于枸櫞酸氯米芬片組(P<0.05)，進一步證實當歸四逆加吳茱萸生姜湯通過增加大鼠子宮內(nèi)膜厚度，提高受孕率。

本研究結(jié)果顯示，不孕癥大鼠造模成功后，大鼠子宮內(nèi)膜組織炎性變化明顯，炎癥因子TNF-α、IL-1、IFN-γ及免疫因子IgG含量明顯升高(P<0.05)。枸櫞酸氯米芬組和當歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠治療后TNF-α、IL-1、IFN-γ、IgG含量均降低(P<0.05)，其中當歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠治療效果優(yōu)于枸櫞酸氯米芬片組(P<0.05)，說明當歸四逆加吳茱萸生姜湯可能通過調(diào)控不孕癥大鼠的免疫應(yīng)答改變，從而在機體內(nèi)產(chǎn)生抗炎抑炎作用。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，造模后大鼠子宮內(nèi)膜組織中HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達顯著升高(P<0.05)，說明HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白在造模后表達出現(xiàn)增強趨勢，這也證實HMGB1、自噬蛋白Beclin-1及其調(diào)節(jié)機制可能與不孕癥的發(fā)病具有一定的相關(guān)性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，枸櫞酸氯米芬組、當歸四逆加吳茱萸生姜湯組大鼠治療后子宮內(nèi)膜組織中HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達水平下降(P<0.05)，且當歸四逆加吳茱萸生姜湯組下降更明顯(P<0.05)，這也說明當歸四逆加吳茱萸生姜湯可有效降低不孕癥模型大鼠子宮內(nèi)膜組織中HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達，進一步調(diào)控自由基釋放，從而抑制炎性反應(yīng)進程。

綜上所述，當歸四逆加吳茱萸生姜湯可通過調(diào)控HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表達，抑制炎癥因子TNF-α、IL-1、IFN-γ及免疫因子IgG反應(yīng)，進而控制不孕癥大鼠炎性反應(yīng)過程。