miR-27a、miR-138-5p 對食管癌患者術后生存情況的預測作用及與復發轉移的關系

周陽 王聰 付民 尹星 常歡 邢艷麗 李毅星 高新雅 王晶

南陽市第二人民醫院腫瘤科（河南南陽 473000）

食管癌為常見的消化道腫瘤，其發生與飲食習慣、遺傳、環境等因素有關。因缺乏可靠的早期診斷方法，食管癌患者初診多為中晚期，預后較差［1］。目前，一些腫瘤標志物如癌胚抗原等開始用于癌癥早期診斷中，但對食管癌的特異度、敏感度不高，無法滿足診斷需求，迫切需要探尋新的分子標志物。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類非編碼小RNA，與腫瘤發生發展存在密切關系，且穩定性極強，不但能輔助腫瘤診斷，還可預測患者預后［2］。據報道［3］，miRNA 往往在惡性腫瘤中表達異常，在腫瘤發生發展過程中發揮癌基因或抑癌基因的作用。miR-27a、miR-138-5p 是分別在多種惡性腫瘤中表達異常的miRNA，作為腫瘤篩查標志物中有一定潛力。MAGHSUDLU 等［4］報道，miR-27a 在食管鱗狀細胞癌中表達上調。WANG 等［5］表明，miR-138-5p 在人類大腸癌中充當腫瘤抑制因子。但miR-27a、miR-138-5p 作為食管癌篩查標志物的鮮有報道。故本研究通過熒光定量PCR 法檢測血清miR-27a、miR-138-5p 表達水平，探討其對食管癌的診斷、術后生存預測以及與患者術后復發轉移相關性，并為食管癌診斷和預后評估提供新的方法。

1 資料與方法

1.1 病例資料本研究納入醫院收治的食管癌患者70 例、慢性食管炎患者230 例、健康體檢者70 例為研究對象，分別設為食管癌組、食管炎組、健康組。

納入標準：（1）食管癌組經術后病理學檢查確診為食管癌；食管炎組經食管造影、內鏡、病理檢查等排除食管癌可能性，確診為慢性食管炎；健康體檢者經查體顯示無惡化器質性病變，健康狀態良好。（2）臨床病理資料完整。（3）神智、溝通能力正常，簽訂了知情同意書。（4）主動配合隨訪、復查。

排除標準：（1）食管癌患者非病理初次確診，或術前接受過免疫治療、抗腫瘤治療等干預。（2）術后3 個月死亡。（3）既往有其他消化道系統疾病。（4）合并嚴重精神病、酒精或藥物濫用史等。三組患者年齡、性別、體質量指數等一般資料比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 三組患者一般資料比較Tab.1 Comparison of general information of three groups of patients

表1 三組患者一般資料比較Tab.1 Comparison of general information of three groups of patients

1.2 方法

1.2.1 血清miR-27a、miR-138-5p 檢測在三組研究對象入院當天，采集清晨空腹靜脈血3 mL，1 500 r/min 離心15 min，離心半徑6 cm，取上清液，保存在-80 ℃冰箱，標本避免反復凍融、溶血。取血清標本，用miRNeasy Mini Kit 試劑盒（北京華夏遠洋科技有限公司）提取miRNA，參考說明書進行。取2 μL 總RNA，用TaqMan miRNA 逆轉錄試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）將其反轉錄為cDNA，用定量即時聚合酶鏈反應法（QRT-PCR）檢測三組受檢者的血清miR-27a、miR-138-5p 表達水平。miR-27a、miR-138-5p 及其內參U6 引物由吉凱基因化學技術有限公司合成，引物序列見表2。PCR 反應體系為20 μL，包括1.2 μL 氯化鎂、10×PCR buffer、0.4 μL 脫氧核糖核苷三磷酸、0.5 μL 上下引物、0.4 μL Taq 酶、1 μL 模板cDNA、14 μL 無RNA 酶雙蒸水。PCR 循環參數：94 ℃5 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃40 s，40 個循環。用2-△△CT法計算miR-27a、miR-138-5p mRNA 相對表達量。

表2 miR-27a、miR-138-5p、U6 引物序列Tab.2 Primer sequences of mir-27a，mir-138-5p and U6

1.2.2 研究方法（1）比較三組受試者血清miR-27a、miR-138-5p 表達水平差異。（2）隨訪3 年，統計食管癌患者復發轉移情況，并分為復發轉移組、無復發轉移組，收集兩組患者資料，包括年齡、性別、體質量指數（body mass index，BMI）、吸煙、飲酒、腫瘤直徑、分化程度、術后化療、術后放療、病理分期、手術根治程度、切緣陽性、淋巴結轉移、血清miR-27a 及miR-138-5p 表達水平。對上述可能導致術后復發轉移的因素賦值，以其為自變量，以是否發生術后復發轉移（否=0，是=1）為因變量，logistic 回歸分析食管癌患者血清miR-27a、miR-138-5p 表達與術后復發轉移的相關性。見表3。（3）隨訪3 年，根據患者術后生存情況分為存活組、死亡組，比較組間血清miR-27a、miR-138-5p 表達水平差異。（4）采用ROC 曲線評估血清miR-27a、miR-138-5p 對食管癌患者術后生存情況的預測價值。

表3 Logistic 回歸分析賦值Tab.3 Logistic regression analysis

1.3 統計學方法采用SPSS 26.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差表示，多組比較用單因素方差分析，兩組比較用獨立樣本t檢驗。計數資料以例（%）表示，進行χ2檢驗。等級資料采取秩和檢驗。用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線及曲線下面積（Area under Curve，AUC）分析血清miR-27a、miR-138-5p 表達水平對食管癌的診斷效能及對患者術后生存情況的預測作用。單因素及logistic 回歸分析食管癌患者血清miR-27a、miR-138-5p 表達與術后復發轉移的相關性。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 食管癌組、食管炎組、健康組血清miR-27a、miR-138-5p 表達水平三組血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相對表達量組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。食管癌組血清miR-27a mRNA 相對表達量高于食管炎組、健康組，食管炎組血清miR-27a mRNA 相對表達量高于健康組（P＜0.05）；食管癌組血清miR-138-5p mRNA 相對表達量低于食管炎組、健康組，食管炎組血清miR-138-5p mRNA 相對表達量低于健康組（P＜0.05）。見表4。

表4 三組血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相對表達量比較Tab.4 Comparison of the relative expression levels of serum mir-27a and mir-138-5p mRNA among the three groups

表4 三組血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相對表達量比較Tab.4 Comparison of the relative expression levels of serum mir-27a and mir-138-5p mRNA among the three groups

注：與食管癌組比較，*P＜0.05；與食管炎組比較，#P＜0.05

2.2 食管癌術后復發轉移組、無復發轉移組的病理參數比較經單因素分析發現，復發轉移組、無復發轉移組的病理分期、手術根治程度和血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相對表達量組間比較差異有統計學意義（P＜0.05），其余病理參數比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5。

表5 食管癌術后復發轉移組、無復發轉移組的病理參數比較Tab.5 Comparison of pathological parameters between postoperative recurrence and metastasis group and non recurrence and metastasis group of esophageal cancer 例（%）

2.3 logistic 回歸分析食管癌術后復發轉移的影響因素病理分期Ⅱ-Ⅲ期、姑息性切除術和血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相對表達量升高均為影響食管癌術后復發轉移的獨立危險因素（P＜0.05）。見表6。

表6 食管癌術后復發轉移的多因素分析結果Tab.6 Multivariate analysis of recurrence and metastasis of esophageal cancer

2.4 存活組、死亡組血清miR-27a、miR-138-5p 表達水平存活組血清miR-27a mRNA 相對表達量低于死亡組，血清miR-138-5p mRNA 相對表達量高于死亡組（P＜0.05）。見表7。

表7 存活組、死亡組血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相對表達量Tab.7 Relative expression levels of serum mir-27a and mir-138-5p mRNA in survival group and death group

表7 存活組、死亡組血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相對表達量Tab.7 Relative expression levels of serum mir-27a and mir-138-5p mRNA in survival group and death group

2.5 血清miR-27a、miR-138-5p 對食管癌患者術后生存情況的預測價值ROC 結果顯示：血清miR-27a、miR-138-5p 預測食管癌術后生存情況的最佳截斷點分別為1.42、0.26，單獨及聯合預測食管癌術后生存情況的AUC 分別為0.773、0.731、0.829。見表8、圖1。

表8 血清miR-27a、miR-138-5p 單獨及聯合檢測對食管癌患者術后生存情況預測價值Tab.8 The predictive value of serum mir-27a and mir-138-5p for postoperative survival of patients with esophageal cancer

圖1 血清miR-27a、miR-138-5p 對食管癌患者術后生存情況預測作用的ROC 曲線圖Fig.1 ROC curve of serum mir-27a and mir-138-5p in predicting survival of patients with esophageal cancer

3 討論

我國是食管癌高發地區，且發病情況存在地域性差異，部分地域發生率極高［6］。目前中晚期食管癌仍以手術結合放化療為主，治療結局不理想，但早期食管癌患者預后相對良好，因此早期診斷、有效防治是目前應對食管癌的最優選擇［7］。當前多種miRNA被作為腫瘤早期診斷、靶向治療的靶點。張兵等［8］報道miRNA 在人類基因組中的比例不高，但能調控人類30%以上的基因表達，在人類疾病特別是惡性腫瘤的生物學行為過程中扮演重要角色。

miRNA 有組織及細胞特異性、高度保守性、時序性，決定了其在不同惡性腫瘤中的表達情況不同［9-11］。miR-27a、miR-138-5p 作為有潛力的分子標志物，參與多種腫瘤生長、分化、轉移、耐藥等過程。LI 等［12］認為miR-27a是腫瘤中的新型生物標志物和潛在的治療靶標。WANG 等［13］研究證明，miR-27a 在食管癌中呈上調表達，可通過干擾其表達水平增強放射敏感性。FRIEDRICH 等［14］認為miR-27a-3p可通過調節轉錄因子cAMP反應元件結合蛋白影響食管鱗狀細胞癌細胞的增殖、凋亡、轉移等生物學行為。GAO 等［15］經薈萃分析證明miR-138表達水平是預測食管癌的潛在預后指標；ZHENG等［16］研究發現miR-138的下調預示了食管鱗狀細胞癌患者的預后不良。本研究結果顯示：從食管癌組到食管炎組、健康組，血清miR-27a 表達逐漸下調，miR-138-5p 表達逐漸上調，提示食管癌患者血清miR-27a表達異常上調、miR-138-5p表達異常下調，與上述研究結果一致，且提示血清miR-27a、miR-138-5p檢測可用于鑒別食管癌。本研究中，病理分期、手術根治程度、血清miR-27a、miR-138-5p mRNA 相對表達量均為影響食管癌術后復發轉移的獨立因素，提示除病理分期、手術根治程度兩項常規因素外，血清miR-27a、miR-138-5p 表達與食管癌患者術后復發轉移密切相關，可能與miR-27a、miR-138-5p 全程參與食管癌發生發展過程有關。CUI 等［17］表明，miR-27a 不但可用于腫瘤早期診斷中，其表達水平與腫瘤分級、患者生存時間相關；LANCA等［18］報道，miR-138可作為非肌肉浸潤性膀胱癌患者預后生物標志物。本研究中，存活組血清miR-27a mRNA相對表達量低于死亡組，血清miR-138-5p mRNA相對表達量高于死亡組，提示其表達水平與患者預后相關，進一步繪制ROC曲線提示二者可準確預測患者術后生存情況，且聯合預測的靈敏度、特異度、準確度更高。

本研究存在樣本量小、隨訪時間短等缺陷，未來研究需增加病例數，延長隨訪時間，便于全面評估血清miR-27a、miR-138-5p 對食管癌患者術后復發轉移的影響及對生存情況的預測價值，為食管癌治療及預后預測提供新的方法。

綜上所述，血清miR-27a、miR-138-5p 表達水平與食管癌患者術后復發轉移相關，可作為診斷食管癌的輔助手段，還可用于預測患者術后生存情況。未來應進一步排除相關影響因素，闡述血清miR-27a、miR-138-5p 對食管癌預后的預測價值。