無創產前檢測技術在胎兒染色體拷貝數變異中的應用

譚玲瓏 黃婷婷 黎俏 鄒永毅 劉艷秋

江西省婦幼保健院醫學遺傳中心，江西省出生缺陷防治管理中心，江西省出生缺陷防控重點實驗室（南昌 330006）

據統計，我國新生兒出生缺陷發生率約為5.6%，隨著出生人口的增加及孕婦高齡化，缺陷出生兒的病例總數也在逐年上升，其中染色體異常是導致新生兒出生缺陷的重要原因之一。目前臨床上應用廣泛的無創產前檢測（non-invasive prenatal test，NIPT）技術可以在產前篩查出染色體異常胎兒，對降低出生缺陷率有很大的幫助。NIPT 是通過抽取母體外周血，對孕婦血漿中胎兒游離DNA 進行高通量測序的技術，用于篩查胎兒21 三體、18 三體、13 三體綜合征的臨床價值已得到肯定，可較好避免部分異常胎兒的出生［1］。隨著NIPT技術的發展，臨床上NIPT可篩查出其他染色體的非整倍體變異及拷貝數變異（copy number variations，CNVs）［2］，當NIPT 提示胎兒CNVs 時建議行羊膜腔穿刺術和染色體分析進一步明確診斷。最常用的方法主要是染色體微陣列分析技術（chromosomal microarray analysis，CMA），CMA 技術可以檢測全基因組水平染色體拷貝數變異［3］，還可檢測嵌合體、雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）及部分單親二倍體（uniparental disomy，UPD）等，較傳統染色體核型分析可額外發現6%～15%的染色體微小變異［4］。本研究通過對NIPT 提示胎兒染色體拷貝數變異的孕婦行羊膜腔穿刺術，提取羊水細胞同時行染色體核型分析及CMA 驗證NIPT 結果［5］，以確定染色體是否異常及異常片段大小，從而探討NIPT 在胎兒染色體拷貝數變異中的應用價值，并評估NIPT 篩查染色體微缺失、微重復的準確性。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2019 年1 月至2021 年1 月在江西省婦幼保健院產前診斷中心就診，因NIPT 結果提示除21、18、13 號染色體及性染色體異常外其他染色體拷貝數變異的樣本114 例，均行羊膜腔穿刺手術，孕婦年齡20～43 歲，妊娠周數18～24 周，術前均簽署產前診斷知情同意書，明確手術流程、手術風險及染色體核型分析技術、CMA技術的意義、局限性。所有標本同時進行染色體核型分析和CMA 分析。根據檢測結果，部分夫婦行外周血染色體核型分析及CMA，與胎兒結果進行比對。最后對所有孕婦妊娠結局進行隨訪登記。

1.2 方法

1.2.1 NIPT 檢測孕婦簽署知情同意書后，采集外周血5 mL，分離血漿，按照SOP 操作要求提取游離DNA 后進行文庫構建和上機測序，最后進行DNA 檢測與數據分析。數據結果判斷用Z 值來表示，Z 值在-3.0～3.0 表示低風險結果，Z 值≥3 提示高風險建議行羊膜腔穿刺術進一步診斷。

1.2.2 羊膜腔穿刺術所有孕婦簽署手術知情同意書，行無菌消毒，于18～28 周在B 超引導下行羊膜腔穿刺術，術中對胎兒、胎盤進行定位，避開損傷胎兒、胎盤的位置進針，無菌抽取30 mL 羊水，其中20 mL 羊水進行細胞培養，10 mL 羊水進行CMA 檢測。

1.2.3 染色體核型分析羊水細胞培養后，收細胞，制片，G 顯帶。每例標本計數20 個中期分裂象，分析5 個核型，當發現嵌合體或異常核型時，加倍計數細胞數目。核型命名根據人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN2016）標準。

1.2.4 染色體微陣列分析采用美國Affy-metrix公司750K 芯片試劑盒及美國Clontech 公司DNA擴增試劑盒，NspI 酶隨機消化DNA 為短片段，連接補齊消化后產物末端，PCR 擴增，利用磁珠法純化、片段化，將產物標記，與芯片雜交后洗片、染色，掃描獲取數據。并進一步采用Chas v4 軟件進行分析及結果判讀。

2 結果

2.1 NIPT 結果本研究選取的114 個病例中，NIPT 提示胎兒拷貝數缺失45 例，拷貝數重復65例，拷貝數缺失合并重復4 例。染色體缺失、重復片段大小方面，CNVs ＞10 Mb 77 例（67.54%），CNVs ≤10 Mb 37例（32.46%）。見表1。

表1 NIPT 篩查染色體缺失、重復的片段大小Tab.1 Segment size of chromosome deletion and duplication screened by NIPT例

2.2 羊水細胞染色體核型分析結果在114例行羊水細胞染色體核型分析病例中，確診異常17 例，異常檢出率為14.9%（17/114）。其中，染色體核型分析結果與CMA 結果比較，另檢出3 例異常，1 例（例24）為染色體復雜平衡易位；1 例（例23）核型47，XN，+9［4］/46，XN［59］為低比例嵌合；1 例（例25）為21 號染色體隨體延長考慮多態性。見表2～5。

表2 胎兒染色體核型分析和CMA 均為異常結果比較Tab.2 Chromosome karyotype analysis and CMA were abnormal results

表3 胎兒染色體核型分析異常結果和CMA 正常結果比較Tab.3 Comparison of abnormal results of fetal chromosome karyotype analysis and normal results of CMA

表4 胎兒CMA 意義不明結果分析Tab.4 Analysis of fetal CMA with unknown significance

表5 胎兒染色體核型分析正常結果和CMA 異常結果比較Tab.5 Comparison of normal results of fetal chromosome karyotype analysis and abnormal results of CMA

2.3 羊水細胞CMA 檢測結果114 例NIPT 提示染色體拷貝數變異的孕婦，CMA 檢測確診異常34 例，符合率29.82%（34/114），其中致病性變異21 例，可能致病變異1 例，意義不明確變異12 例，見表2～5。

2.4 后期隨訪結果對114 例行產前診斷孕婦進行了隨訪，21 例CMA 結果提示致病性變異，其中19 例夫妻雙方經知情同意后選擇了引產，2 例已正常出生，家長代述均生長發育正常；1 例CMA 結果提示為可能致病變異胎兒已正常出生；12 例CMA 結果提示為臨床意義不明確變異，其中2 例胎兒已引產，8 例胎兒已出生，家長代訴孩子體檢均未見異常，2 例正常妊娠中，四維彩超、后期超聲均未提示異常；1 例CMA 結果提示正常而染色體核型結果提示平衡易位攜帶者已正常出生；1 例CMA 結果提示正常而染色體核型結果提示9 號染色體低比例嵌合最終選擇引產；1 例CMA 結果提示正常而染色體核型結果提示21 號染色體隨體延長已正常出生。其他77 例CMA 檢測結果正常胎兒目前未發現其他異常。

2.5 遺傳性胎兒染色體片段缺失或重復CMA提示胎兒染色體缺失或重復的病例中，有7 例明確來源，分別遺傳自母親或為新發突變，見表6。

表6 遺傳性胎兒染色體片段缺失或重復Tab.6 Hereditable fetal chromosomal fragment deletion or duplication

3 討論

染色體微缺失微重復是除染色體非整倍體外的一類常見的染色體異常，是導致新生兒出生缺陷的原因之一［6-7］，有研究［8］顯示CNVs 導致的微缺失、微重復綜合征占所有新生兒先天性異常的1%～2%。目前臨床上應用廣泛的NIPT 技術在產前篩查胎兒的常見染色體異常（如21 三體、18 三體、13 三體綜合征等）時有較高的準確性。隨著NIPT技術的發展，越來越多的研究［9］發現NIPT 也可篩查出其他染色體的非整倍體變異及CNVs。

羊水細胞染色體核型分析是胎兒染色體異常診斷的金標準［10］。染色體核型分析可以檢測染色體數目異常、大的結構異常、平衡易位、低比例嵌合等，但由于技術的局限性，僅能發現＞10 Mb 的染色體異常［11］，運用高分辨率顯帶技術可以檢出4～5 Mb 以上的染色體異常［12］。本研究中檢出17例染色體核型異常與NIPT 結果相符，其中1 例胎兒為復雜平衡易位攜帶者、1 例胎兒9 號染色體低比例嵌合（6.3%）而CMA 結果提示正常、1 例提示胎兒21 號染色體隨體延長考慮多態性。

CMA 技術可以檢測全基因組CNVs，還可檢測嵌合體、雜合性缺失及部分單親二倍體等［13］，對于NIPT 提示胎兒CNVs，建議行染色體核型分析聯合應用CMA，以提高染色體異常檢出率［14］。本研究中，114例NIPT 提示染色體拷貝數變異的孕婦行產前診斷，CMA 檢測確診異常34 例（29.82%），與姜楠、吳莉等［15-16］的數據報道較為一致。本研究中，經CMA 診斷34 例異常中，29 例與NIPT 篩查結果基本一致，陽性符合率為85.3%（29/34），僅5 例不一致。NIPT 篩查染色體缺失、重復的片段大小比較，可以發現染色體片段越大，檢出率越高，有文章報道CNV ≥5 Mb 時，NIPT 檢出率達到90.9%，CNV ≤5 Mb 時，NIPT檢出率僅有14.3%［17］。分析染色體片段較小未被檢出，考慮可能與胎兒游離DNA濃度過低、胎盤限制性嵌合、測序深度不夠、測序數據量不足等因素有關［18］。CMA 34 例異常結果中檢出臨床意義不明確變異12 例，針對致病性不確定CNVs 病例，臨床上建議夫婦雙方抽血行CMA 與胎兒結果比對。本研究7對夫婦行CMA對照，其中6 例胎兒拷貝數變異與其母親一致（5 例已正常出生，1 例正常妊娠中），1 例為新發突變（選擇終止妊娠）。據此，可以考慮胎兒拷貝數不確定變異大多是遺傳自雙親，考慮臨床表現正常，但由于本研究夫婦比對樣本量較少，仍需進一步驗證［19］。

本研究對114 例行產前診斷孕婦進行了隨訪，21 例CMA 結果提示致病性變異，其中19 例夫妻雙方經知情同意后選擇了引產，2 例經臨床咨詢現已出生，1 例22 號染色體q11.21 區段有2.83 Mb片段重復，夫婦CMA 比對結果顯示胎兒母親攜帶22q11.21 重 復；另1 例Xp22.31 有1.68 Mb 片 段 缺失，夫婦CMA 比對結果顯示胎兒母親攜帶Xp22.31缺失，經臨床咨詢告知女性存在X 染色體失活，但男性異常X 染色體出現臨床表型。對12 例CMA結果提示臨床意義不明隨訪，8 例出生，2 例正常妊娠中，2 例胎兒終止妊娠，其中1 例11 號染色體q21q22.1 區段有6.41Mb 片段缺失，夫婦行CMA 比對，雙方結果均正常，臨床咨詢告知可能風險，最終選擇終止妊娠。其他77 例CMA 檢測結果正常胎兒目前已出生60 例，17 例正常妊娠中，均未發現其他異常。

綜上所述，NIPT 是一項無創傷、無流產、無感染、準確率高、檢出率高并廣泛應用于臨床的新技術。隨著胎兒拷貝數變異檢出率的不斷提高，染色體異常胎兒也隨之被檢出，因此，NIPT 對CNVs具有一定的預測價值。同時，對于NIPT 提示胎兒染色體微缺失、微重復，專家建議行產前診斷聯合應用染色體核型分析及CMA 檢測技術以明確診斷，根據結果必要時行夫婦雙方染色體核型分析或CMA 比對，為臨床遺傳咨詢提供意見及依據。NIPT 檢測存在假陽性結果，這樣也導致了一部分不必要的產前診斷及增加了胎兒流產、感染等風險，故臨床應用需謹慎。總之，NIPT 具有廣泛的臨床應用價值同時該檢測方法需要不斷優化。