上調miR-1322通過靶向TRPV4對胃癌SGC7901細胞凋亡和遷移的影響

朱鐘鐘 姜進平 黃耿 羅海平 湯守元

1鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院湖北理工學院附屬醫(yī)院胃腸肛腸外科，黃石 435000；2鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院湖北理工學院附屬醫(yī)院泌尿外科，黃石 435000

胃癌是最常見的惡性消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率呈逐年增加的趨勢［1］。胃癌易轉移且其早期癥狀不明顯，大部分患者臨床確診時已在中晚期，治療效果有限，5 年生存率很低［2］。由此，探究胃癌的分子治療靶點和診斷標志物是胃癌研究領域的熱點。微小RNA（microRNA，miRNA）由前體pre-microRNA 經(jīng)過剪切生成，起初被認為不具有特定生物學功能，是基因轉錄過程的副產(chǎn)物［3］。越來越多研究表明，miRNA 與腫瘤的產(chǎn)生、進展、轉歸顯著相關［4-5］。微小RNA-1322（miR-1322）被證實在多種腫瘤（如肝癌、食管鱗癌、肺腺癌等）組織或細胞株中低表達，以不同的作用機制抑制癌癥的發(fā)生和進展，可能與癌癥患者的預后相關［6-7］。miR-1322 在 胃 癌 中 鮮 有 報 道 ，于 2020 年 8 月 至 2021 年6 月，本研究通過慢病毒感染上調SGC7901 細胞miR-1322 的表達，觀察其對胃癌SGC7901 細胞遷移及凋亡的影響，探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑 胃癌SGC7901 細胞購于中國科學院上海細胞所；DMEM 培養(yǎng)基和胰蛋白酶購于美國Gibco 公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega 公司；Transwell 小室購自美國康寧公司；慢病毒（GV112）購于上海吉凱生物科技有限公司；實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑盒購于日本TaKaRa公司；細胞凋亡試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司；Transwell 小室購于美國Corning 公司；一抗天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白3（caspase 3）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白8（caspase 8）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、瞬時受體電位香草酸4（TRPV4）和辣根過氧化物酶標志的二抗購于美國CST公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和感染 SGC7901 細胞接種在含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱（5%CO2）中培養(yǎng)。將SGC7901 細胞接種在六孔板，根據(jù)慢病毒感染說明書（感染復數(shù)為20），細胞匯合度為60%時感染，分為2 組：對照組感染空白慢病毒，miR-1322 組感染miR-1322 慢病毒載體。感染8 h后更換新的培養(yǎng)基，采用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定感染的SGC7901細胞株。

1.3 生物信息學預測miR-1322 的靶基因 用PicTar（https：//pictar.mdc-berlin.de/）預測 miR-1322 的靶基因，TRPV4可能是miR-1322的靶基因。

1.4 qRT-PCR 檢 測 miR-1322 和 TRPV4 mRNA 的 表達 待感染后的SGC7901 細胞匯合度達70%，TRIzol 法提取SGC7901 細胞株總RNA。定量RNA 純度和濃度，逆轉錄RNA 為cDNA。測定miR-1322相對表達以U6為內參，測定TRPV4 mRNA 相對表達以GAPDH 為內參，進行qRT-PCR擴增，運用2-ΔΔCt方法計算結果。引物序列如下，miR-1322 正向引物：5’-GATGATGCTGCTGATGCTG-3’，反 向 引 物 5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’；TRPV4 正向引物：5’-CTACGGCACCTATCGTCACC-3’，反向引物5’-TTAGGCGTTTCTTGTGGGTCA-3’。

1.5 流式細胞術檢測SGC7901 細胞的凋亡 收集胰蛋白酶消化的SGC7901 細胞，使用重懸2 組細胞，分別加入Annexin V-FITC 試劑和PI 染液，充分混合均勻，在4 ℃下避光放置35 min。加入Annexin V-FITC 結合液，使用流式細胞儀檢測SGC7901細胞凋亡的情況。

1.6 Transwell 實驗檢測SGC7901 細胞的遷移能力將2 組SGC7901 細胞進行饑餓處理，收集胰蛋白酶消化的SGC7901 細胞，將200 μl 無血清細胞懸液接種于Transwell小室上室，將700 μl完全培養(yǎng)基加至Transwell小室下室，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 h。通過4%多聚甲醛固定SGC7901細胞，通過結晶紫染液染色SGC7901 細胞。通過PBS 溶液充分洗滌，在100倍倒置顯微鏡下拍照。

1.7 Western blot 檢測TRPV4 基因蛋白表達 提取2 組 SGC7901 細胞總蛋白并測蛋白濃度，每孔加入 40 μg 蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，聚偏二氟乙烯膜轉膜2.0 h。9%脫脂牛奶封閉1.5 h。根據(jù)不同蛋白分子量裁剪條帶，于一抗中保存過夜。于辣根過氧化物酶標志的二抗中保存3.5 h。根據(jù)1∶1 比例制備ECL 發(fā)光液，在曝光儀內曝光、顯影和拍照。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料均以均數(shù)±標準差（）表示，每個實驗均重復3 次，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 miR-1322 在SGC7901 細胞中的過表達情況 對照組和miR-1322 組miR-1322 的表達分別為（1.01±0.07）和（12.96±1.05），miR-1322 組 miR-1322 表 達 是 對 照組 的12.83 倍（t=6.30，P＜0.01），提示感染miR-1322 慢病毒載體成功。

2.2 過表達miR-1322 促進SGC7901 細胞的凋亡 細胞凋亡結果顯示（圖1），對照組和miR-1322 組SGC7901 細胞凋亡比例分別為（6.95±1.02）%和（32.88±6.22）%。與對照組相比，miR-1322組SGC7901細胞凋亡比例明顯增加（t=4.11，P＜0.01），說明過表達miR-1322后SGC7901細胞凋亡增加。

圖1 過表達miR-1322對SGC7901細胞凋亡的影響（A為對照組，感染空白慢病毒載體；B為miR-1322組，感染胃癌SGC7901細胞）

2.3 過表達miR-1322 抑制SGC7901 細胞的遷移 如圖2，對照組和miR-1322 組SGC7901 細胞遷移數(shù)分別為（107.30±10.94）個和（43.44±8.04）個。與對照組相比，miR-1322 組 SGC7901 細胞遷移數(shù)顯著降低（t=4.28，P＜0.01），說明過表達miR-1322后SGC7901細胞遷移減少。

圖2 過表達miR-1322對SGC7901細胞遷移的影響（A為對照組，感染空白慢病毒載體；B為miR-1322組，感染胃癌SGC7901細胞）

2.4 生物信息學預測miR-1322 的靶基因 用PicTar軟件預測 miR-1322 的靶基因，TRPV4 可能是 miR-1322 的靶基因，miR-1322與TRPV4基因的結合位點見圖3。

圖3 miR-1322與TRPV4基因的互補結合位點

2.5 過表達miR-1322 抑制SGC7901 細胞中TRPV4 mRNA 表達 對照組和 miR-1322 組 SGC7901 細胞中TRPV4 mRNA 的表達分別為（1.01±0.09）和（0.26±0.03），與對照組相比，miR-1322組SGC7901細胞TRPV4 mRNA 表達降低（P＜0.01），說明 miR-1322 負調控 TRPV4 mRNA 的表達。

2.6 TRPV4 蛋白和凋亡及遷移相關蛋白的表達Western blot 結果表明（圖 4），miR-1322 組 SGC7901 細胞TRPV4 蛋白表達顯著下調，細胞凋亡蛋白caspase 3、caspase 8表達增加，細胞遷移蛋白β-catenin表達降低。

圖4 miR-1322對TRPV4蛋白和凋亡、遷移相關蛋白表達的影響

3 討 論

越來越多的miRNA 被發(fā)現(xiàn)與胃癌細胞的惡性行為密切相關［8-9］。如miR-146b-5p 在胃癌組織中表達明顯低于癌旁組織，在合并淋巴轉移和遠處轉移的胃癌患者中可見更低水平的miR-146b-5p，體外過表達miR-146b-5p 減弱了胃癌細胞的增殖和遷移潛能［10］。Shi等［11］研究發(fā)現(xiàn)，外泌體源性的miR-1246 在胃癌患者和健康對照人群血清中差異有統(tǒng)計學意義，miR-1246 可能成為胃癌早期診斷的生物標志物。miR-1322 是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA，不具有編碼蛋白的功能［6］。Zhao 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，miR-1322 能夠抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，同時促進肝癌細胞的凋亡。Wu等［6］研究發(fā)現(xiàn)，miR-1322通過誘導自噬，增強埃克替尼耐藥的肺腺癌細胞對埃克替尼的敏感性。miR-1322 在胃癌細胞中的作用機制并不清楚，其可能作為抑癌因素參與胃癌的進展。本研究發(fā)現(xiàn)，上調SGC7901細胞中miR-1322表達后，SGC7901 細胞凋亡比例增加，細胞遷移能力明顯減弱，提示miR-1322在胃癌中是一種抑癌因素。

miRNA 主要通過以序列不完全或完全互補與靶基因mRNA3’非翻譯區(qū)相互結合，促進靶基因mRNA 的分解，阻滯靶基因 mRNA 的翻譯［12-13］。為了探究 miR-1322 在胃癌中的作用機制，本研究用PicTar 軟件預測miR-1322 的靶基因，TRPV4可能是miR-1322的靶基因。TRPV4蛋白是一種通道蛋白，包括 871 個氨基酸［14］。TRPV4 蛋白在多數(shù)腫瘤組織或細胞中表達上調，其通過抑制凋亡蛋白表達從而抑制細胞凋亡的發(fā)生，同時TRPV4 蛋白可通過降低細胞的剛度促進細胞的遷移［15-16］。TRPV4 蛋白在胃癌組織中表達升高，參與促進胃癌的進展［17］。qRT-PCR 和Western blot結果表明，上調miR-1322的表達后，TRPV4基因表達顯著下降，表明TRPV4 mRNA 翻譯過程被抑制。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，miR-1322組SGC7901細胞TRPV4蛋白表達降低后，細胞凋亡蛋白caspase 3、caspase 8 表達增加，細胞遷移蛋白β-catenin 表達降低。TRPV4 基因表達改變可能是對照組和miR-1322組細胞凋亡和遷移能力差異的關鍵。

綜上所述，上調miR-1322 可促進胃癌SGC7901 細胞的凋亡，抑制細胞的遷移能力，其機制可能與TRPV4基因表達改變有關。miR-1322 對胃癌的發(fā)生發(fā)展有抑制作用，可能成為胃癌治療的分子靶點。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。