我國部分地區禽多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及耐藥情況分析

嚴專強 麥凱杰 羅翠芬 周祺 楊德鴻 申翰欽 周慶豐

摘 要：為調查禽多殺性巴氏桿菌的流行情況，本研究從我國華東、華南和西南等區域8個省市家禽養殖場疑似禽霍亂發病群中分離出17株多殺性巴氏桿菌。血清型鑒定發現所有分離株均為莢膜A型。藥敏結果顯示分離株對阿莫西林、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢吡肟和復方新諾明等藥物敏感，對卡那霉素、四環素、慶大霉素和鏈霉素等藥物耐藥。

關鍵詞：多殺性巴氏桿菌;分離鑒定;血清型;耐藥性

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：B 文章編號：1673-1085（2021）11-0045-06

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida， PM）是引起禽類禽霍亂、豬萎縮性鼻炎、牛羊出血性敗血癥等疾病的重要致病菌，家禽急性感染通常可見肺部出血，肝臟、脾臟有大量白色壞死點，死亡率較高[1]。多殺性巴氏桿菌的血清型根據莢膜抗原可分為A、B、D、E和F五個型，禽霍亂常由A和F型多殺性巴氏桿菌引起[2]。根據血清型制備滅活疫苗進行免疫是一種有效的預防措施，由于疫苗對異源血清型菌株的保護有限，因此監測流行菌株的血清型非常有必要。臨床生產中多用抗生素進行治療，隨著菌株對常用藥物敏感性的降低，藥物治療越來越困難。本研究通過調查不同地區禽多殺性巴氏桿菌的流行血清型和耐藥情況，旨在為臨床禽霍亂疾病的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

TSA（Tryptic Soy Agar）和TSB（Tryptic Soy Broth）培養基，購自美國BD公司;胎牛血清，購自內蒙古金源康生物工程有限公司;2 × PCR mix，購自南京諾唯贊生物科技有限公司;藥敏片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 樣本采集與細菌分離

2018～2021年從浙江、福建、廣東、江蘇、四川、重慶、湖南和貴州8個省市的規模化養殖場采集疑似禽霍亂發病禽群肝臟或頭部樣品共17份，并將采集的樣品于2～8 ℃條件下當天帶回實驗室進行瑞氏染色鏡檢和細菌分離。

無菌使用接種環取樣品劃線于添加5%胎牛血清的TSA平板，于37 ℃條件下在5%CO2恒溫培養箱培養18～36 h，然后挑取大小均一的優勢單菌落于添加5%胎牛血清的TSB培養基中放37 ℃搖床200 r/min純化培養12～24 h。

1.3 PCR鑒定

取純化培養的菌液制備DNA模板，以多殺性巴氏桿菌標準菌株CVCC 44801作為陽性對照，根據GenBank登錄號CP058991.1序列設計一對引物QI（表1），與文獻報道的引物（KMT）進行二重PCR鑒定[3]，同時出現與預期片段大小一致的兩條帶則可確診為多殺性巴氏桿菌。根據文獻報道[3]多殺性巴氏桿菌莢膜分型方法，合成相應引物（表1）進行PCR鑒定分型，確定其莢膜血清型。菌液鑒定和莢膜分型PCR反應條件均為：95 ℃預變性3 min;循環內95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸按照1 000 bp延伸1 min，總35個循環;72 ℃后延伸10 min。產物進行電泳后于凝膠成像儀觀察。

1.4 藥敏試驗

多殺性巴氏桿菌對營養有一定要求，因此本試驗使用添加5%胎牛血清的TSA平板進行藥敏試驗（K-B法）。將培養好的純化菌液調整濃度至OD600=0.08～0.13，使用滅菌棉簽將菌液均勻涂布于2塊TSA平板上，放置10～15 min后將阿莫西林、大觀霉素、環丙沙星、頭孢曲松、氨芐西林、頭孢吡肟、卡那霉素、四環素、慶大霉素、強力霉素、復方新諾明和鏈霉素共12種抗生素藥敏片均勻貼于平板上，藥敏片之間至少間隔2 cm以上，于37 ℃條件下在5%CO2恒溫培養箱培養18～36 h。根據美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）的標準來判斷菌株耐藥性。

2 結果

2.1 多殺性巴氏桿菌的分離鑒定

從浙江、福建、廣東、江蘇、四川、重慶、湖南、貴州8個省市的規模化養殖場共分離出17株多殺性巴氏桿菌，其中番鴨源分離株13株，黃羽肉雞源分離株4株（表2）。病料樣品瑞氏染色鏡檢可見大小不一、兩極濃染的短桿狀細菌，分離菌在TSA平板培養呈現透明的圓形、露珠狀菌落，見圖1。

2.2 PCR鑒定

特異性鑒定引物擴增結果顯示，分離菌株的QI引物擴增片段長度為305 bp，KMT引物擴增片段長度為460 bp，均與多殺性巴氏桿菌標準菌株CVCC 44801的標準陽性對照片段大小相符，鑒定確診為多殺性巴氏桿菌（圖2）。莢膜分型結果顯示所分離菌株擴增片段長度為1 044 bp，與預期的Type A擴增片段長度一致，結果表明分離的17種巴氏桿菌均為莢膜A型（圖3）。

2.3 藥敏試驗

藥敏試驗結果顯示，阿莫西林、頭孢曲松、頭孢吡肟、復方新諾明、氨芐西林對分離株抑菌效果最好，分別有100%、100%、100%、100%、94.1%的菌株敏感。對卡那霉素、四環素、鏈霉素、慶大霉素的耐藥菌株最多，占比分別為35.3%、35.3%、35.3%、29.4%（表3）。

3 討論

多殺性巴氏桿菌在養禽業中有著較大的危害，通常以散在爆發的形式流行于各個地區[4，5]。本研究分離的17株巴氏桿菌來自我國華東、華南和西南等區域8個省市的水禽和黃羽肉雞主養殖區，流行區域跨度較廣。從菌株分離時間來看，該疾病常年均可發生，但在高溫、高濕、多雨的夏秋季節分離率顯著升高。因此在該疾病流行區域，應在高發時間段前，通過加強生物安全或疫苗免疫等方式著重進行預防。

本研究藥敏試驗結果顯示分離株對阿莫西林、頭孢曲松、復方新諾明等青霉素類、頭孢菌素類和磺胺類抗生素十分敏感，對卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素等氨基糖苷類抗生素和四環素類抗生素較為耐藥。本研究藥敏結果與陶婭等[4]、Xiao等[5]報道的藥敏結果比較一致，與陳國權等[6]、王紅琳等[7]報道的藥敏試驗結果有很大不同，提示多殺巴分離株耐藥性存在差異，可能與不同區域養殖場的禽霍亂發病頻率和治療用藥習慣有關。

本研究揭示了我國部分地區禽巴氏桿菌的流行血清型和菌株耐藥情況，為禽霍亂疾病的免疫防控和藥物治療提供了數據參考。

參考文獻：

[1] WILKIE I W， HARPER M， BOYCE J D， et al. Pasteurella multocida： diseases and pathogenesis [J]. Curr Top Microbiol Immunol， 2012， 361： 1-22.

[2] CARTER G R. Studies on Pasteurella multocida. I. A hemagglutination test for the identification of serological types[J]. Am J Vet Res， 1955， 16： 481-484.

[3] TOWNSEND K M， BOYCE J D， CHUNG J Y， et al. Genetic organization of Pasteurella multocida cap Loci and development of a multiplex capsular PCR typing system[J]. J Clin Microbiol， 2001， 39： 924-929.

[4] 陶婭，王鉉皓，李軍朝，等.禽源多殺性巴氏桿菌的分離及生物學鑒定[J]. 中國獸醫雜志，2019，55（04）：92-94.

[5] Xiao J F， Li Y J， Hu Z H， et al. Characterization of Pasteurella multocida isolated from ducks in China from 2017 to 2019[J]. Microb Pathogenesis， 2021，160： 105196.

[6] 陳國權，張旭，閻朝華，等. 鴨源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]. 中國畜牧獸醫，2020，47（02）：620-628.

[7] 王紅琳，盧琴，張騰飛，等.鴨源莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定[J]. 湖北農業科學，2019，58（12）：116-119.