外周血DNA檢測技術在孕婦胎兒異常染色體中與羊水穿刺技術對比分析

文 /王鵬，張寶仁，金蓮華

據統計顯示，我國大概有90萬例/年新生兒出現生理缺陷，其中比較常見的原因是異常DNA，發病率可達0.6%，其中又以21-三體綜合征較為高發[1]。基因的載體是染色體，異常DNA表達代表身體異常，基因表達異常，目前臨床對其發病機制還未完全明確，研究認為跟DNA多種因素共同作用下發生斷裂與重新連接有關[2]，在臨床檢查中多以羊水染色體核型分析作為此病診斷金標準，但畢竟是有創傷檢查，孕婦依從性不高，而且操作煩瑣，出結果用時長，難以把它作為普遍篩查項目[3]。隨著近年來無創產前基因檢測技術的迅猛發展，其廣泛檢測應用于孕婦胎兒染色體異常。本文旨探討無創DNA檢測技術在孕婦不同年齡及申請理由檢測胎兒染色體異常的臨床應用。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2017年5月至2019年5月在浦東新區婦幼保健院接受產前診斷中心無創產前篩查（NIPT-plus)的孕婦3123位，納入指標:（1）全部研究對象病歷,檢驗檢查項目及B超數據完整;（2）全部孕婦都沒有任何身體異常表現,沒有臨床異常數據，NITP檢查全部自愿，并于知情同意書簽字；（3）不納入指標：雙胞胎以及以上者孕婦,短期內接受過干細胞治療，免疫治療、及短期內手術或有輸血史。本文在經過院倫理委員會批準后進行。

1.2 方法

（1）①收集標本：孕婦取坐姿休息5分鐘后使用血常規抗凝管采取孕婦4-5ml靜脈血，在離心機內以1500rmin的轉率離心15分鐘，移液器采集血漿，對分離血漿進行再次離心，去除殘留血細胞；②收集游離DNA：使用磁珠分離從收集血漿樣本中經裂解、分離、純化并提取游離DNA，為確保能夠進行下一步實驗，且保證DNA片段多態性具有代表性。收集過程需要建立SOP文件,保證采集血液的合格性。③制作檢測測序庫：將制備好的DNA片段行尾端恢復、補全，同時進行測序斷基因擴增，文庫和分純,必須按所有操作按SOP文件進行，擴增后DNA濃度要大于0.2ng/mg，且DNA片段在150-200bp之間[4]；④測序與分析：使用3500測序儀(ABI)對DNA片段的基因序列,行電泳,提純分析數據。對DNA檢測結果為高風險孕婦進行相關咨詢征得孕婦同意后進行介入產前診斷。

（2）羊水染色體核型分析通過超聲定位后穿刺抽取孕婦羊水25ml，離心后取0.5ml沉淀、培養，得到分裂中期細胞，然后經過低滲、固定、吉姆薩染色處理，最后進行染色體核型分析。

（3）跟蹤訪問經電話或者查詢我院病歷記錄等方式跟蹤外周血DNA檢測陰性產婦后續情況（包括有無流產、小孩身體情況等）。

1.3 統計學處理

通過SPSS28.0統計學軟件進行數據的統計學分析。計量資料用均數標準差表述;計數資料采用例或百分率表示，計算NITP檢測數據的敏感度及差異。

2 結果

（1）孕期不同NIPT陽性分布孕早期檢出異常比例1.10%(10913)，孕中期異常比例0.95%(151575),孕晚期異常比例0.94%(7635)。詳見表1。

表1 不同孕期NIPT陽性分布

（2）申請理由不同者NIPT異常分布高年齡段檢出異常1.2%(10831)，外周血DNA異常比例0.94%(9957)，B超指標異常占1.1.1%(7635)，其他自己申請NIPT檢查異常占0.71%(5700)。詳見表2。

表2 不同申請NIPT理由者NIPT陽性分布

3 討論

新生兒出現生理缺陷主要是由胚胎發育異常導致。其表現多為智力缺陷或器官形體或功能異常，胚胎異常主要由遺傳因子決定，給家庭和社會帶來沉重負擔。為了解決新生兒出現生理異常，產前檢查顯得尤為重要[5]。遺傳物質的載體是染色體，異常染色體是最常見出生缺陷原因[6]。盡管NITP已被廣泛應用于產前非整數倍體應用當中,且檢查為無創的,但對于比較罕見的染色體異常的臨床應用價值逐漸被學者們提出異議,有學者認為染色體疾病并非流行性疾病,流行率較低,缺乏充分證據證明染色體檢查有必要作為產前篩查指標，但血清學產前篩查是三級防控中的二級防控中重要的環節，對于我國出生缺陷防控有著重要意義[7]。但現階段血清學篩查陽性率有限，就算是四聯血清學篩查檢測，陽性檢出率也只有80%左右，且假陽性率較高[8]。NIPT因其無創性廣受孕婦接納。對以往的大面積篩查實驗當中表明，使用NITP產前篩查能大量地降低羊水穿刺作為產前診斷金標準帶來的創傷性檢查，也在一定程度上降低了醫療資源的過度浪費和無效使用.診斷的目的在于防止新生兒有嚴重的染色體疾病，現階段各類實驗證明外周血DNA檢測能夠準確地檢測出一批染色體疾病的新生兒，然而因為費用等問題，深度測序的CNV在用于臨床篩查顯得不切實際，所以采用低深度的外周血DNA檢測作為臨床篩查更顯得極為重要，在保證了準確性和無創性的同時又保持了成本的可控，同時還實現了NITP的高效性。隨著我們對數據庫的不斷完善社會對外周血DNA檢測會逐漸認可，逐漸發揮其無創和準確的優點，未來造福人類。總之外周血DNA檢測具有良好的效能，靈敏度和特異性都能滿足現有臨床需求。當然臨床上應該進一步研究更具優良的方法[9-12]。