不同性別平衡易位攜帶者胚胎植入前遺傳學檢測相關遺傳學分析

何 萍 李哲濤 王文丹 韋朔峰 嚴提珍

廣西壯族自治區柳州市婦幼保健院醫學遺傳科（柳州市生殖醫學重點實驗室），廣西柳州 545001

染色體是承載遺傳信息的特有物質。人類體細胞的染色體數目為23對，包括22對常染色體和1對性染色體，并有特定的形態和結構。一旦染色體數目或形態結構發生改變，稱為染色體異常。而染色體異常是導致不育、復發性流產、胚胎停育、畸胎、死胎、出生缺陷等發生的主要原因。而染色體平衡易位是染色體結構異常中發生率極高的一大類。染色體平衡易位攜帶者，指的是無遺傳物質丟失的染色體結構異常，且無臨床表型者，其發生率為1/500[1]。染色體平衡易位攜帶者，雖然其表型正常，但是在其生育過程中，由于染色體重組時可產生高比例的非平衡配子，而極易導致不育、復發性流產、胚胎停育、畸胎、死胎、出生缺陷等不良生育史的發生[2]。根據生殖細胞減數分裂機理，理論上，常染色體相互平衡易位攜帶者可有18種配子產生，羅氏易位可有6種配子產生，但由于易位發生的染色體組別、片段大小、位置及易位發生片段所攜帶功能基因以及攜帶者性別等不同，臨床上其能形成成熟配子、胚胎及生長至不同發育階段胚胎臨床上有很大差異。

胚胎植入前遺傳學檢測（preimplantation genetic testing，PGT）是輔助生殖技術與遺傳學檢測技術相結合的，近年迅速發展起來的新型孕前診斷技術，通過體外受精（in vitro fertilization，IVF）或者卵胞漿內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）在胚胎植入宮腔前，對胚胎或者對卵裂球或極體行活檢，通過染色體核型分析和基因檢測而獲得無疾病表型的優質胚胎的輔助生殖技術。針對染色體平衡易位攜帶者，PGT的出現，可以阻止復發性流產、胚胎停育、畸胎、死胎、出生缺陷等的發生成為可能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取柳州市婦幼保健院2017年1月至2021年6月行外周血染色體檢查的不孕不育夫婦進行核型分析，篩選出平衡易位攜帶者，并對平衡易位攜帶者夫婦實施輔助生殖技術，對囊胚期胚胎采用高通量測序技術進行PGT。

1.2 方法

1.2.1 外周血染色體核型分析 受檢者簽署知情同意書后采集外周血2 ml進行常規染色體培養、制片后，進行染色體G顯帶核型分析，篩選染色體平衡易位攜帶者。

1.2.2 體外受精培養及胚胎活檢 根據卵巢功能選擇合適的促排方案，于取卵后4 h行ICSI，授精后16～18 h檢測受精情況，胚胎培養至第3天評估胚胎生長情況。正常授精后第3天卵裂球≥6個，碎片<20%，卵裂均勻者視為優質胚胎。于第5天或者第6天囊胚期進行胚胎活檢，并取出適量滋養外胚層細胞用于后續檢測。

1.2.3 胚胎植入前遺傳學檢測 活檢細胞樣本轉移至聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）管，采用植入前胚胎染色體非整倍體檢測試劑盒（貝瑞和康）進行全基因組擴增，擴增后進行文庫構建和純化，然后通過Next Seq CN500測序平臺（Illumina公司）對擴增產物進行測序，通過科孕安數據分析系統（貝瑞和康）對測序原始數據進行生物信息學分析，并參考人類基因組hg19版本出具胚胎植入前染色體結構變異檢測（preimplantation genetic testing for structural rearrangements，PGT-SR）報告。質控要求：DNA 濃度≥10 ng/μL，原始數據過濾后 reads≥2.7 M，Q30 的堿基百分比≥80%，分析標準為Uniq reads≥1.5 M，對染色體進行整倍體、微缺失及微重復的判讀，判讀范圍：23對染色體非整倍體、4 Mb及以上片段的缺失/重復、30%及以上的嵌合。

1.3 觀察指標

通過高通量測序進行PGT，獲得不同性別的平衡易位攜帶者囊胚期胚胎染色體組類型和構成情況，包括可移植胚胎（正常/平衡易位攜帶胚胎）、單純不平衡胚胎（親代染色體易位導致染色體重排引起的染色體非整倍體或者拷貝數變異）、散發性異常胚胎（非親代染色體易位相關的染色體非整倍體或拷貝數變異）、復雜性異常胚胎（同時包括前面兩種異常情況）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計數資料采用率（±s）表示，組間比較采用 χ2檢驗，以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 染色體平衡易位攜帶者外周血染色體核型分析

通過染色體核型分析，共篩選出113對其中一方為染色體平衡易位攜帶者的夫婦，女性攜帶者42例，男性攜帶者71例（表1）。

表1 染色體平衡易位攜帶者外周血染色體核型分析

2.2 染色體平衡易位攜帶者囊胚期胚胎高通量測序結果分析

應用高通量測序行PGT-SR檢測，共檢測738個囊胚期胚胎，來自男性攜帶者461個，女性攜帶者277個，檢測失敗15個（來自男性攜帶者8個，女性攜帶者7個）。獲得可移植胚胎168個，其中來自男性攜帶者的126個，來自女性攜帶者的42個。男性相互平衡攜帶者獲得可移植胚胎率、單純不平衡胚胎率、散發性異常胚胎率、復雜性異常胚胎率分別為27.8% （126/453）、19.6% （64/327）、41.6% （136/327）、38.8%（127/327）；女性相互平衡攜帶者獲得可移植胚胎率、單純不平衡胚胎率、散發性異常胚胎率、復雜性異常胚胎率分別為15.5%（42/270）、25.9%（59/228）、32.9%（75/228）、41.2%（94/228）。不同親本來源的可移植胚胎率比較，差異有統計學意義（父源27.8%，母源 15.5%，χ2=15.253，P<0.05），單純不平衡胚胎率比較，差異無統計學意義（父源19.5%，母源25.9%，χ2=3.096，P>0.05），不同親本來源的散發性異常胚胎率比較，差異有統計學意義（父源41.6%，母源32.9%，χ2=4.310，P<0.05），不同親本來源的復雜性異常胚胎率比較，差異無統計學意義（父源38.9%，母源41.2%，χ2=0.320，P>0.05）（表 2）。

表2 染色體平衡易位攜帶者囊胚期胚胎高通量測序結果分析[%（n/N）]

3 討論

染色體結構發生異常改變是導致不育、復發性流產、胚胎停育、畸胎、死胎、出生缺陷等發生的主要遺傳學病因。PGT作為新型的孕前診斷技術，針對染色體平衡易位攜帶者，在胚胎植入前篩選非整倍體異常胚胎，獲得正常或平衡易位攜帶優質胚胎，從而顯著減少不育、復發性流產、胚胎停育、畸胎、死胎、出生缺陷等的發生。

另外，PGT的取材主要來源于卵母細胞極體、卵裂球及囊胚滋養外胚層。卵裂球是臨床上應用最廣的PGT活檢來源[3]。許多來咨詢PGT的平衡易位攜帶夫婦，既希望通過PGT獲得正常或平衡易位攜帶優質胚胎，又擔心活檢會對胚胎本身造成不利影響。國內外多項研究表明在胚胎發育至第3天移走1～2個細胞并不影響胚胎的后續發育[4]，但是活檢的材料少，卵裂期胚胎存在高嵌合率[5]，為35%～40%，影響PGT的準確性。囊胚滋養外胚層可以活檢2～10個細胞，相較于卵母細胞極體、卵裂球單細胞活檢，其能提供更多的材料，提高了PGT的準確性，且不涉及發育成胎兒部分的內細胞團，從而避免了活檢對胚胎所造成的不利影響[6]。另外，囊胚期胚胎嵌合體發生率較低，許多研究表明囊胚期活檢優于卵裂期活檢[7]。

理論上，根據生殖細胞減數分裂原理，常染色體相互平衡易位攜帶者可以產生18種配子，1/18概率染色體完全正常，1/18概率染色體平衡易位攜帶而臨床表型無明顯異常，其余16/18均為部分單體或者三體不平衡異常配子，后者臨床表現通常為不育、流產、畸胎、死胎、及出生缺陷等。換句話說，理論上常染色體平衡易位攜帶者可有2/18（11%）概率獲得正常子代可能，不同親本來源對正常子代獲得率沒有影響。有些研究認為，不同親本來源獲得的實際可移植胚胎率（正常子代獲得率）可能與理論值不一致，染色體相互易位的遺傳風險與相互易位攜帶者性別相關，不同性別的攜帶者獲得可移植胚胎比例可能存在差異[8-9]。本研究結果顯示，男性相互平衡易位攜帶者獲得可移植胚胎率為27.8%（>11%），女性相互平衡易位攜帶者獲得可移植胚胎率為15.5%（>11%），不同性別的攜帶者獲得可移植胚胎比例均高于理論值。

有些研究認為，不同親本來源的正常子代獲得率與理論概率是存在差異性的，Zhang等[10]研究相互易位親本來源對子代減數分裂染色體分離方式發現，男性相互易位攜帶者正常平衡胚胎率為42.71%，女性攜帶者為38.85%；Idowu等[11]研究發現男性平衡易位攜帶者獲得整倍體胚胎比例為25%，女性平衡易位攜帶者為26%。在本研究中，男性相互平衡易位攜帶者獲得可移植胚胎率為27.8%（126例），女性相互平衡易位攜帶者獲得可移植胚胎率為15.5%（42例），不同親本來源的獲得可移植胚胎率比較，差異有統計學意義（P<0.05），男性攜帶者獲得可移植胚胎率明顯高于女性攜帶者，具有統計學意義，與Mateu-Brull等[12-13]研究相符，但與Zhang等[10]的研究結果不一致。通過分析比較發現，上述研究結果的非一致性主要源于研究對象選擇及研究方法的差異，Zhang等[10]將平衡易位作為整體研究對象，忽略了相互平衡易位與羅氏易位遺傳風險的背景差異，而Idowu等[11]研究方法主要采用SNP array技術，有研究表明NGS能發現更多拷貝數變異和低比例的嵌合體[14]，本研究應用了NGS技術，但是沒有詳細羅列出相互平衡易位與羅氏易位的結果比較。

理論上，針對常染色體相互平衡易位攜帶者，其產生的部分單體或者部分三體一般源于發生相互易位的染色體。早期胚胎植入前遺傳學診斷主要采用熒光原位雜交技術檢測親本相互易位的染色體是否異常[15-16]。然而近些年進展性研究發現，配子異常不僅僅局限于出現相互易位的染色體，其他染色體也會發生散發性染色體非整倍體變異或拷貝數變異，或者同時包括相互易位的染色體和其他染色體。隨著NGS技術在染色體平衡易位攜帶者植入前遺傳學檢測應用逐步廣泛，以其高分辨率、高通量、一次性檢測更多CNV、準確性高、費用少、診斷迅速，將成為PGT強有力的檢測手段[17-19]。本研究結果顯示，男性相互平衡易位攜帶者單純不平衡胚胎率為19.6%（64例），女性相互平衡易位攜帶者為25.9%（59例），不同親本來源的單純不平衡胚胎率比較，差異無統計學意義（P>0.05），女性相互平衡易位攜帶者單純不平衡胚胎率略高于男性攜帶者，但不具有統計學意義；男性相互平衡易位攜帶者散發性異常胚胎率為41.6%（136例），女性相互平衡易位攜帶者為33.9%（75例），不同親本來源的散發性異常胚胎率比較，差異有統計學意義（P<0.05），男性相互平衡易位攜帶者散發性異常胚胎率明顯高于女性攜帶者，具有統計學意義；男性相互平衡易位攜帶者復雜性異常胚胎率為38.8%（127例），女性相互平衡易位攜帶者為41.2%（94例），不同親本來源的復雜性不平衡胚胎率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

綜上所述，本研究比較分析不同性別的染色體相互平衡易位攜帶者囊胚期胚胎染色體構成情況及影響，結果表明，女性相互平衡易位攜帶者獲得可移植胚胎比例低于男性攜帶者，單純不平衡胚胎及復雜性異常胚胎比例比較，差異無統計學意義（P>0.05），可能與研究數據相對有限相關，而散發性異常胚胎比例為男性相互平衡易位攜帶者明顯高于女性攜帶者，差異有統計學意義（P<0.05）。因此，染色體相互平衡易位攜帶行PGT時，遺傳咨詢應考慮親本來源對子代胚胎產生的不同影響并告知患者知情。值得一提的是，不同親本來源獲得可移植胚胎比例均高于理論值，及不同性別相互平衡易位攜帶者均存在6%～30%未獲得可移植胚胎的可能[20]，也在PGT遺傳咨詢時充分考慮到并告知患者知情。本研究能夠為臨床提供較為客觀精確的遺傳咨詢指導意見，但由于本研究的研究對象有限，仍需更大的樣本數進行更精確的相關研究。