結(jié)膜Ⅳ號方對形覺剝奪豚鼠中度近視的影響

鄧宇，訾迎新，劉自強(qiáng)，農(nóng)璐琪，秦亞麗，金明

近視是一種世界性的高發(fā)疾病，其發(fā)病年齡在我國逐年提前，患病率急速上升[1]。近視的發(fā)展與鞏膜重塑有關(guān)，鞏膜基質(zhì)降解增加、膠原合成減少、膠原纖維直徑變細(xì)、蛋白聚糖含量減少，鞏膜組織變薄，眼軸進(jìn)行性延長是近視發(fā)生發(fā)展過程中的重要因素[2]。本研究使用結(jié)膜Ⅳ號方灌胃，觀察形覺剝奪豚鼠中度近視度數(shù)發(fā)展、眼軸長度、鞏膜形態(tài)的變化。探究結(jié)膜Ⅳ號方灌胃對形覺剝奪性近視發(fā)展的影響，為臨床治療提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 18 只2 周齡花豚鼠，體重120～200 g，購買自北京科宇動物養(yǎng)殖中心，許可證號：SCXK(京)2017.0002。飼養(yǎng)條件：室溫25℃，空氣相對濕度45%～50%，予以12 h 光照(500 lux)，黑暗循環(huán)，期間實驗豚鼠自由進(jìn)食水，每日給予新鮮蔬菜等以補(bǔ)充維生素C。

1.1.2 主要儀器 A 型眼科超聲測量儀（型號：ODM-1000，天津邁達(dá)醫(yī)學(xué)科技有限公司），帶狀光檢影鏡（型號：YZ24，蘇州六六視覺科技股份有限公司）。

1.1.3 主要藥物 10%水合氯醛（中日友好醫(yī)院臨床研究所提供），左氧氟沙星滴眼液（批號：M356711，參天制藥株式會社中國有限公司），復(fù)方托吡卡胺滴眼液（批號：M356711，參天制藥株式會社中國有限公司），鹽酸奧布卡因滴眼液（批號：B1008，參天制藥株式會社中國有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理 將18 只豚鼠隨機(jī)分為中藥組、模型組和對照組，每組6 只。中藥組和模型組均予左氧氟沙星滴眼液點右眼，每25 min 點1 次，共9 次。按照5 mL/kg 體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，于腹腔內(nèi)注射100 g/L 濃度戊巴比妥鈉麻醉劑，1 min 后使用眼科手術(shù)剪將豚鼠上、下瞼緣切開約3 mm，手術(shù)縫合線沿切口縫合。術(shù)畢用氧氟沙星眼膏涂抹，并紗布遮蓋，建立形覺剝奪性近視模型。縫合后每日予以氧氟沙星眼膏涂抹預(yù)防感染，觀察縫線是否脫落，每日更換紗布遮蓋術(shù)眼，其余飼養(yǎng)條件不變。左眼不予任何處理。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：豚鼠術(shù)后右眼的屈光度在-3.25～-6.00 D之間。眼瞼縫合完成后第2 d，中藥組予10 g/kg 結(jié)膜Ⅳ號方湯劑（黃精、石斛、珍珠母等）灌胃，模型組予10 g/kg 生理鹽水灌胃。對照組僅予10 g/kg 生理鹽水灌胃，不做其他處理。共灌胃6 周，每日1 次。

1.2.2 屈光度數(shù)檢查方法 于干預(yù)前后均使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分散大右眼瞳孔，行點狀光檢影鏡檢影驗光，重復(fù)驗光3 次，并取平均值，將1/2 的柱鏡度數(shù)計入球鏡度數(shù)。

1.2.3 眼軸檢查方法 于干預(yù)前后均使用鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉右眼后測量眼軸，將A 超儀探頭垂直角膜平面，對準(zhǔn)瞳孔中心，減少探頭對角膜的壓力，取較穩(wěn)定、清晰且晶狀體后囊膜和視網(wǎng)膜雙峰均高于基線的圖形為確定圖像，測量右眼，每眼重復(fù)測量8 次，取平均值。

1.2.4 取材 干預(yù)后對3 組豚鼠按照15 mL/kg 體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，于腹腔內(nèi)注射100 g/L 濃度戊巴比妥鈉麻醉劑，剪開右眼眼瞼縫合后行檢影驗光及測眼軸（方法同前），測量完成后處死所有豚鼠，摘除右側(cè)眼球后，將其置于冰塊上保存，環(huán)形剪開角膜緣，將眼前節(jié)及玻璃體去除。

1.3 鞏膜組織形態(tài)病理學(xué)觀察

選取后段鞏膜組織固定于40 g/L 多聚甲醛溶液內(nèi)，脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡400倍下觀察鞏膜組織著色情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0 進(jìn)行分析，計量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組內(nèi)比較采用配對t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組豚鼠眼軸比較

造模前后比較，3 組均較造模前增長，差異有統(tǒng)計 學(xué)意 義（t中藥組=-39.250，t模型組=-50.289，t對照組=-16.783，均P=0.000）。與對照組比較，中藥組和模型組均增長，均有統(tǒng)計學(xué)意義（t中藥組=5.260，P=0.003；t模型組=24.783，P=0.000）。與模型組比較，中藥組縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-11.313，P=0.000）（表1）。

2.2 3 組豚鼠屈光度數(shù)比較

造模前后比較，中藥組和模型組較造模前均升高，對照組較造模前降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t中藥組=33.871，t模型組=52.492，t對照組=11.656，均P=0.000）。與對照組比較，造模后中藥組及模型組屈光狀態(tài)呈近視，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t中藥組=-26.294，t模型組=-39.571，均P=0.000），與模型組比較，中藥組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.479，P=0.018）（表1）。

表1 3 組豚鼠眼軸長度、屈光度數(shù)比較（±s，n＝6）

表1 3 組豚鼠眼軸長度、屈光度數(shù)比較（±s，n＝6）

注：* 與同組造模前比較，P＜0.05；# 與對照組比較，P＜0.05；△與模型組比較，P＜0.05

2.3 3 組豚鼠鞏膜形態(tài)比較

3 組豚鼠鞏膜成纖維細(xì)胞染色，細(xì)胞核均呈藍(lán)紫色，梭形或長圓形，細(xì)胞外基質(zhì)呈粉紅色。對照組鞏膜厚度及形態(tài)大致正常，鞏膜膠原纖維排列整齊，走行正常，直徑均勻；中藥組鞏膜膠原纖維分布較為稀疏，排列不規(guī)則，可見明顯扭曲、分離、變細(xì)，鞏膜膠原纖維有明顯纖維空隙，細(xì)胞外基質(zhì)較對照組增多；模型組鞏膜膠原纖維排列與中藥組情況相似，膠原纖維排列不規(guī)則，但纖維分離程度及細(xì)胞外基質(zhì)明顯較中藥組大，且有斷裂現(xiàn)象（圖1）。

圖1 各組豚鼠鞏膜形態(tài)HE 染色圖（×400）。1A 中藥組；1B 模型組；1C 對照組

3 討論

形覺剝奪性近視(form deprivation myopia，F(xiàn)DM)學(xué)說創(chuàng)立于1977 年，美國Wiesel 等[3]縫合新生恒河猴的眼瞼后，縫合眼發(fā)生明顯的軸性近視，后續(xù)研究顯示FDM 近視的發(fā)展主要與眼軸的伸長，脈絡(luò)膜、鞏膜變薄。FDM 可影響鞏膜膠原纖維的形態(tài)和分布，使膠原纖維直徑變小、細(xì)胞外基質(zhì)減少，從而使鞏膜變薄[4-5]。豚鼠的鞏膜與人類組成相似，主要由I 型膠原蛋白和少量III 型和V 型膠原蛋白組成，并與彈性蛋白和蛋白多糖結(jié)合在一起[6]，是國內(nèi)外眾多實驗常用的FDM 模型動物[7]。

本實驗觀察了結(jié)膜Ⅳ號方對中度近視FDM 豚鼠鞏膜形態(tài)、膠原纖維排列及厚度的影響。造模前后相比中藥組近視度數(shù)、眼軸長度變化絕對值均低于對照組，說明使用結(jié)膜Ⅳ號方延緩了FDM 豚鼠近視的發(fā)展，減慢了眼軸的生長。中藥組較對照組鞏膜厚度及膠原纖維排列有明顯差異，中藥組形態(tài)整體好于對照組，說明結(jié)膜Ⅳ號方可阻止后鞏膜延伸，減少FDM 過程中鞏膜基質(zhì)損傷，增強(qiáng)鞏膜結(jié)構(gòu)，有緩解FDM 近視發(fā)展的作用。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為近視當(dāng)屬于“能近怯遠(yuǎn)癥”，這既是近視的癥狀也是近視的中醫(yī)病名，《諸病源候論》[8]曰：“目不能視遠(yuǎn)者，目為肝之精華，勞傷臟腑，肝氣不足，兼受風(fēng)邪，使精氣衰弱，故不能遠(yuǎn)視”，現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)對近視的研究[9-10]多認(rèn)為近視的形成當(dāng)屬于陽虛陰盛、肝腎不足等證，治療上以溫補(bǔ)陽氣，調(diào)補(bǔ)肝腎，活血通絡(luò)等為主。結(jié)膜Ⅳ號方是金明教授使用多年的經(jīng)驗方，全方以酒黃精為君，歸肺脾腎三經(jīng)，其味甘、性平，補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾潤肺益腎，補(bǔ)肺脾腎三臟之陰。鐵皮石斛入胃腎二經(jīng)，可補(bǔ)養(yǎng)胃腎二臟之陰，主治腎陰不足導(dǎo)致的目暗不明，陰虛火旺。珍珠母入心、肝二經(jīng)，有清肝明目退翳之效，與酒黃精、鐵皮石斛相配伍可養(yǎng)肝明目，治療肝虛目暗，視物昏花。臨床使用發(fā)現(xiàn)可以有效緩解青少年近視度數(shù)發(fā)展。綜上所述，本實驗結(jié)論表明結(jié)膜Ⅳ號方可以延緩FDM 豚鼠近視發(fā)展，抑制鞏膜伸長，增強(qiáng)鞏膜結(jié)構(gòu)作。