姜黃素通過Akt-mTOR信號通路調控細胞自噬對骨關節炎大鼠的保護作用研究

曹舒興 周楠 王進 趙立輝 曹光 馬維 李明

骨關節炎(Osteoarthritis,OA)是一種伴有疼痛的致殘性進行性退行性疾病。據統計，髖關節和膝關節的OA殘疾患者從1990年的1 050萬增加到2010年的1 710萬[1]。其主要病變為軟骨退變，包括軟骨細胞的死亡和細胞外基質的降解。目前雖然提出了很多方式預防延緩OA的發生，但還未發現有效的治療方法來逆轉疾病的進展[1]，此外，目前大部分OA藥物在長期使用過程中出現了嚴重的不良反應。因此，探索新型安全性治療方法對OA患者來講是必要的。細胞自噬作為一種內源性保護機制,它通過清除細胞內未折疊的蛋白和受損的細胞器，在骨關節炎的發生和進展過程中發揮著重要作用，近年來逐漸成為新的治療靶點[2,3]。mTOR(哺乳動物雷帕霉素靶蛋白,the mammalian target of Rapamycin，mTOR)屬于PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶,phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)蛋白激酶類家族中成員，是許多與自噬相關的信號通路交匯節點，而且與骨關節炎有著密切的聯系[4-6]，其中Akt-mTOR信號通路對自噬起重要的負調控作用。姜黃素是從姜科姜黃屬植物根莖中提取的一種天然酚性色素，其抗炎抗氧化的特性使姜黃素在改善OA的中藥領域中脫穎而出[7,8]。據報道，姜黃素可以調控一系列信號通路的抑制和激活，包括核因子激活的B細胞的κ-輕鏈(nuclear factor-k-gene binding,NF-kB)通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信號通路、信號轉導與轉錄激活子(signal transducer and activator of tran-ions,STAT)通路等等[9]。但目前關于姜黃素對骨關節疾病的作用和機制研究較少。因此，本研究以大鼠OA模型為研究對象，以 PI3K-Akt-mTOR信號通路為切入點,探討姜黃素通過調控細胞自噬減輕大鼠OA的作用及可能機制，為OA的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF清潔級SD雄性大鼠由河北醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(冀)2018-1-003，雄性，200～240 g，在恒溫恒濕、明暗交替的環境中喂養，均可自由獲得水和食物，飼養1周后用于實驗。所有動物實驗按照本院動物保護機構和倫理委員會的批準進行。

1.2 主要試劑與儀器 姜黃素、尼古丁均購自Sigma公司；TUNEL試劑盒購自Abcam公司；抗體 β-actin、procaspase-3、caspase-3及其活化狀態(Active p19、Active p17)、Bax、Bcl-2、LC3、Beclin 1、p62、p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt及其下游激酶P70小體S6激酶(p70 ribosomal S6 kinase，P70S6K)等抗體均購自 CST 公司。DMEM 培養基、PBS、胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素、RIPA 裂解液、BCA 試劑盒、BlueRanger預染蛋白質量標準購自美國Thermo公司。組織切片機(德國徠佧);酶標儀(Tecan，Mannedorf，Switzerland)，電泳及轉移系統(Bio-Rad公司,美國)，Odyssey掃 描儀(LiCor公司,美國),普通倒置顯微鏡及熒光顯微鏡(Olympus公司,日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備及給藥：30只SD大鼠隨機分為假手術組，手術組和治療組，每組10只。采用改良Hulth法制備大鼠膝關節OA模型，即取髕骨旁內側切口顯露膝關節，切斷前后交叉韌帶及內側副韌帶，切除2/3半月板，保留關節面。假手術組只暴露膝關節前后交叉韌帶及內側副韌帶，而不作任何其他處理。假手術組、手術組給予PBS灌胃，治療組在術后即灌胃給藥(姜黃素50 mg·kg-1·d-1)，連續給藥8周[9]。

1.3.2 軟骨細胞的分離與培養：將假手術組、手術組、治療組大鼠的膝關節軟骨組織切成<1 mm的碎片，用0.25 g/L胰蛋白酶消化，然后用2 g/L的膠原酶Ⅱ孵育8 h，未消化的組織用180 μm細胞過濾器過濾，1 500 r/min離心10 min，錐蟲藍染色，檢測細胞活力。在添加體積分數10%胎牛血清(100 U/ml青霉素和0.1 g/L鏈霉素)的DMEM中培養軟骨細胞，細胞培養于37℃，體積分數5%CO培養箱中。在通路Akt-mTOR檢測部分，提取進行改良Hulth法手術后的大鼠膝關節軟骨組織細胞原代培養，分為4組：分別為手術組(原代細胞不額外添加其他試劑)、姜黃素組(添加40 μmol/L姜黃素處理24 h)、尼古丁組(添加2.5 μmol/L尼古丁處理24 h，該濃度可以顯著激活mTOR通路且不影響細胞狀態)、姜黃素+尼古丁組(姜黃素處理前2 h給予尼古丁(2.5 μmol/L)進行處理)，以上各組處理24 h后收集細胞進行測試。

1.3.3 脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dTUP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)染色：在姜黃素處理8周后，處死動物進行原位凋亡檢測，膝關節樣品用福爾馬林固定，脫鈣，石蠟包埋，切片經二甲苯脫蠟和分級濃度的醇脫水后，用原位凋亡檢測試劑盒TUNEL染色進行軟骨細胞凋亡分析，光鏡下檢測陽性信號。采用TUNEL染色(綠色)和DAPI核復染(藍色)來評估軟骨細胞凋亡。凋亡率(%)定義為每個切片同一平面內陽性細胞核總數與現存細胞總數之比。比較各組細胞凋亡率，并進行統計學分析。

1.3.4 組織檢查和免疫組化：番紅-O固綠染色可評估軟骨退化情況，原理在于嗜堿性的軟骨與堿性染料番紅O結合呈現紅色。切片固定后用番紅-O染色，鏡檢。軟骨和軟骨下板厚度的蛋白多糖缺失根據Mankin評分方法進行評估。切片常規脫蠟后進行LC-3的免疫組織化學染色。

1.3.5 Western blot檢測：使用含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液從大鼠軟骨組織/軟骨原代細胞中提取胞漿蛋白，等量的蛋白質(30 μg)在SDS-PAGE凝膠上分離并電泳，將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h，用一抗孵育膜過夜，第2天PBST洗3次后，二抗室溫孵育1 h，PBST洗3次，暗房曝光。采用Image J對條帶進行灰度值分析。

2 結果

2.1 姜黃素可降低OA的嚴重程度 通過番紅-O染色和Mankin’s評分評估關節軟骨結構特征來確定姜黃素對OA大鼠的影響。術后8周，大鼠出現OA病理學特征，表現為番紅-O染色紅色減少，細胞密度下降。治療組軟骨細胞密度增加，表明姜黃素可減輕大鼠OA嚴重程度。定量分析手術組軟骨厚度明顯低于假手術組(P<0.05)，以及姜黃素處理后治療組延緩了組織降解(P<0.05)。此外，與假手術組相比，手術組的Mankin’s評分顯著升高(P<0.05)，姜黃素治療組的Mankin’s評分顯著降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 術后8周假手術組、手術組、治療組關節軟骨番紅-O染色

表1 3組相對軟骨厚度及Mankin’s評分

2.2 姜黃素抑制大鼠OA軟骨細胞凋亡 為了進一步研究姜黃素對OA中軟骨細胞凋亡的影響，我們對關節軟骨進行TUNEL染色分析，采用TUNEL染色和DAPI核復染來評估軟骨細胞凋亡。與假手術組相比，術后8周OA大鼠出現軟骨退化，軟骨細胞凋亡明顯增強。姜黃素治療后，TUNEL陽性細胞數量減少，大鼠軟骨損傷改善，細胞凋亡減少。Western blot檢測凋亡相關標志物進一步證實了姜黃素對OA細胞凋亡活性的影響：caspase-3的激活以及Bax/Bcl2比值在姜黃素治療后明顯被抑制(P<0.05)。見表2，圖2、3。

表2 3組細胞凋亡標記物相對蛋白量

圖2 3組OA大鼠關節軟骨組織中caspase-3和Bax/Bcl-2的相對蛋白表達

圖3 姜黃素抑制OA大鼠軟骨細胞凋亡TUNEL染色分析(×40)

2.3 姜黃素增強OA大鼠軟骨細胞自噬 自噬是正常軟骨的另一種保護機制。為了探討姜黃素對自噬的影響，我們對OA大鼠關節組織LC-3的表達進行了免疫組化分析，姜黃素治療組大鼠LC-3的表達明顯高于手術組。Western blot檢測了自噬相關標志物LC3-Ⅰ/Ⅱ和Beclin1的表達水平，進一步證實了這一觀察結果：與未治療大鼠相比，姜黃素治療后LC3-Ⅰ/Ⅱ和Beclin1的表達均顯著升高，而p62的表達顯著降低(P<0.05)。見圖4、5，表3。

2.4 姜黃素通過AKT/mTOR通路調控軟骨細胞自噬

圖4 姜黃素可有效促進OA大鼠軟骨細胞自噬(免疫組×40)

圖5 姜黃素抑制OA大鼠軟骨細胞凋亡相關標志物表達

表3 3組軟骨細胞自噬相關標志物相對蛋白量比較

Western blot結果顯示，mTOR、Akt、及其下游激酶p-P70s6k在OA大鼠中的表達水平較高，而姜黃素處理后mTOR、Akt、p-P70s6k的表達水平較未處理大鼠顯著降低(P<0.05)。Akt和mTOR的磷酸化位點分別為Ser473和Ser2448，提示AKT/mTOR通路可能參與姜黃素對OA大鼠軟骨細胞自噬的調控過程。為了進一步確定姜黃素對軟骨細胞自噬的調控是否依賴于Akt/mTOR，我們提取了進行改良Hulth法手術后的大鼠膝關節軟骨組織細胞原代培養，分別添加40 μmol/L姜黃素、2.5 μmol/LAkt/mTOR通路激活劑尼古丁、姜黃素聯合尼古丁[姜黃素處理前2 h給予尼古丁(2.5 μmol/L)進行處理]，以上各組處理24 h后收集細胞進行測試。當給予姜黃素+尼古丁處理后，相比于單純給予姜黃素，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平明顯下降(P<0.01)。結果證實了姜黃素對軟骨細胞自噬的調控作用依賴于Akt/mTOR信號通路。見表4、5，圖6、7。

表4 3組Akt/mTOR通路相對蛋白量比較

表5 尼古丁預處理后4組Akt/mTOR通路相對蛋白量比較

圖6 3組關節軟骨組織中p-mTOR, p-Akt, p-P70S6K蛋白表達水平

圖7 尼古丁激活后各組p-mTOR, p-Akt, p-P70S6K蛋白表達水平

3 討論

OA是一種進展緩慢的疾病，伴有明顯的關節軟骨喪失和纖維化。年齡增長是OA發病和進展的主要危險因素[10]。然而，由于關節不穩定和生物力學改變而導致的韌帶斷裂在10～15年后導致人類發生OA[11,12]。因此，手術不穩定模型已成為實驗動物中最常見、最流行的OA模型[13]。與自發性模型相比，外科手術模型發病速度更快，變異更少，以及對遺傳背景的依賴更小[14]。

在本研究中，我們采用Hulth法誘導大鼠OA模型，結果表明，姜黃素能有效改善OA模型大鼠的關節軟骨損傷，并且這種改善是通過促進自噬實現的。姜黃素誘導的自噬增強與OA模型大鼠Akt/mTOR信號通路有關。

大量的臨床實驗已經證實姜黃素對OA具有治療作用[15]。姜黃素保護軟骨的機制之一是其抗軟骨細胞凋亡的作用。一項研究通過免疫印跡和電鏡[3]檢測表明姜黃素可抑制IL-1β刺激的人軟骨細胞凋亡。在本研究中，我們觀察到OA大鼠關節軟骨體中凋亡的軟骨細胞顯著增加。

動物和人類膝關節軟骨的衰老與自噬減少有關，主要表現為自噬關鍵調控因子包括ULK1、Beclin 1和LC3[16]的表達降低。Beclin1通過使自噬相關蛋白聚集并啟動自噬；LC3可以調控自噬泡的形成，其中LC3-Ⅰ型能夠通過泛素化修飾轉變為LC3-Ⅱ型，后者數量與自噬體數量成正比；而p62能夠和待降解物結合，隨著自噬作用的增加而不斷地被消耗[16,17]。與衰老相關的OA一樣，手術誘導的OA小鼠也表現出自噬減少和相關的凋亡增加[17]。通過對健康人和OA患者關節軟骨自噬基因表達分析顯示，在OA組織中LC3、Beclin1等20個下調的自噬相關基因，這些變化與細胞死亡/凋亡的重要調控因子上調[18]有關。已有文獻表明，蔗糖[19]、雷帕霉素[20]等生物活性成分對OA的治療作用與通過調控Akt/mTOR信號通路增加自噬有關。Akt屬于一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是調控mTOR最重要的直接上游分子，細胞內Akt蛋白的磷酸化后即被激活、進而活化下游mTOR(最關鍵的自噬負調控因子)，細胞自噬抑制水平可以在很大程度上從Akt-mTOR通路的激活程度反映[17-19]。本研究中，我們的實驗結果表明，在OA模型中LC3和Beclin1下調，Akt/mTOR通路激活，自噬減少；姜黃素治療后，LC3和Beclin1上調，Akt/mTOR通路抑制，自噬增加，且我們在姜黃素聯合尼古丁處理的軟骨原代細胞中驗證了姜黃素調節軟骨自噬作用依賴于Akt/mTOR通路。

綜上所述，我們的研究結果表明，姜黃素通過Akt/mTOR信號通路誘導自噬，在OA大鼠中發揮了治療作用。在此次研究中尚有不足：第一，不同濃度的姜黃素對大鼠軟骨組織修復有何影響路還未闡明，在今后的研究中將通過不同濃度、不同治療時間的姜黃素處理以明確此問題；第二，仍需要進一步細胞實驗支持此次研究的發現，更加明確姜黃素對細胞自噬的潛在作用。