細胞因子與重癥肌無力分型及臨床病程的相關性研究

梁翠娟 馮蘇 范蓉 趙東蘭 宋國威 潘婧

重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)是由自身抗體介導的細胞免疫依賴的獲得性自身免疫疾病[1]，多種免疫細胞包括Th1、Th17細胞、B細胞及細胞因子IL-6、IL-17、IL-27、TGF-β、IL-21被認為參與了重癥肌無力的發病[2]。在動物模型中，IL-6抗體可以降低抗乙酰膽堿抗體(anti-AChR)水平，并下調IL-17、IL-21等表達。TGF-β可促進效應及調節性T細胞的分化，IL-6和TGF-β可誘導細胞分化為Th17細胞，促進炎癥及自身免疫發生，在自身免疫性疾病中發揮著重要作用。同時IL-6和可以促進B細胞增殖分化成熟為成熟漿細胞。自身抗原在IL-17敲除小鼠不能或僅能誘導低水平抗乙酰膽堿抗體[3]。IL-27在自身免疫性疾病發病中具有復雜的作用，可拮抗IL-6，在多種自身免疫性疾病動物模型中抑制自身性免疫性疾病的發生。本研究對重癥肌無力患者血清細胞因子進行檢測，以期了解上述細胞因子與疾病表型、病程的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 我院2018年4～6月診治的重癥肌無力患者，診斷及分型標準參考《中國重癥肌無力診斷和治療指南2015》[1]，其中眼肌型26例，全身型24例。對照組為同期于我院進行體檢的年齡和性別匹配的健康志愿者29例。在重癥肌無力患者中，初發期(眼肌型13例，全身型6例)，穩定期18例(眼肌型9例，全身型9例)，加重期13例(眼肌型4例，全身型9例)。各期患者及對照組年齡及性別比差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、2。

1.2 納入與排除標準 納入標準：近期無急慢性感染。排除標準：(1)合并慢性或急性炎癥性疾病疾病；(2)合并惡性腫瘤；(3)合并精神性疾病；(4)合并其他疾病或使用可能影響上述細胞因子水平的治療藥物。

表2 不同病程階段一般情況比較

1.3 判定標準 初發期為初次入院未進行任何治療；穩定期為至少半年無肌無力的癥狀或體征,在此期間接受過MG 的藥物治療;經專業的神經肌病醫生檢查允許出現輕微眼瞼閉合無力；加重期為與穩定期相比，肌無力臨床癥狀明顯加重或MG治療藥物劑量明顯增加。參考美國重癥肌無力基金會MGFA 干預后狀態分級癥狀描述。

1.4 細胞因子檢測 采用ELISA法測定血清IL-6、TGF-β、IL-17、IL-21、IL-27濃度，由Multiskan FC酶標儀讀取OD值，然后進行統計學分析。所用試劑盒為欣博盛QuantiCyto ELISA試劑盒IL-6(批號H171222-007a)、IL-17(批號H171222-170a)、IL-21(批號H171222-107a)，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 統計學分析 應用SPSS 26.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，計量資料根據數據分布類型(非正態分布)采用秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組與不同分型重癥肌無力患者細胞因子水平比較 對照組血清IL-6水平[2.78(2.29～3.47)pg/ml]顯著低于眼肌型[4.47(3.00～8.87)pg/ml]及全身型[4.61(2.56～9.42)pg/ml]重癥肌無力患者(P<0.05)，而眼肌型與全身型重癥肌無力患者之間差異無統計學意義(P>0.05)。其他細胞因子TGF-β、IL-17、IL-21、IL-27血清濃度在各組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表3，圖1。

表3 對照組與眼肌型、全身型重癥肌無力患者細胞因子比較 pg/ml,median(IQR)

圖1 不同臨床分型重癥肌無力患者血清細胞因子比較

2.2 對照組及不同病程重癥肌無力患者血清細胞因子比較 (1)血清IL-6：對照組低于初發階段的重癥肌無力患者(P<0.05)，而與穩定期、癥狀加重期重癥肌無力患者之間差異無統計學意義(P>0.05)。不同病程階段的重癥肌無力患者之間差異無統計學意義(P>0.05)。(2)血清IL-17、IL-21、IL-27、TGF-β：在對照組及各不同病程階段重癥肌無力患者之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表4，圖2。

3 討論

IL-6可激活B細胞和T細胞，誘導Th17和Tfh細胞分化，并直接抑制Treg細胞，在自身免疫性疾病中發揮著重要的作用[4-6]。本研究并未發現眼肌型和全

表4 對照組及不同病程重癥肌無力患者細胞因子水平比較 pg/ml,median(IQR)

圖2 健康對照和不同病程階段重癥肌無力患者細胞因子比較

身型重癥肌無力患者血清IL-6存在顯著性差異，這與一部分研究的結果[7]是類似的，而另外一些研究則發現，全身型重癥肌無力患者血清IL-6水平要高于眼肌型患者[6]，這種差異可能由于入組患者病情嚴重程度不同所致，本研究中的全身型重癥肌無力患者均為Ⅱ型及Ⅲ型。本研究發現，初發期重癥肌無力患者血清IL-6水平顯著高于健康對照者，而穩定期及加重期的患者血清IL-6水平與健康對照組差異無統計學意義。我院重癥肌無力科對兒童眼肌型重癥肌無力患者經健脾益氣顆粒治療前后的細胞因子進行了比較，發現治療后12個月時血清IL-6、IL-17水平低于治療前，并與臨床癥狀緩解相關[8]。重癥肌無力患者血IL-6升高的原因并不完全明確。在重癥肌無力患者中，LPS可能通過上調P2X7R，增加IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α等促炎因子釋放[5]。在重癥肌無力動物模型及患者肌細胞中可以觀察到IL-6表達增加，體外試驗更進一步證實，抗-AChR抗體可誘導人類肌細胞生成IL-6明顯增加，并且這種作用是通過調節轉錄或通過轉錄后調節機制而非肌細胞增殖實現的[9]。此外，還有研究表明重癥肌無力患者胸腺上皮細胞功能異常，可過量分泌IL-1、IL-6等細胞因子。IL-6獨自或與其他細胞因子協同，參與免疫應答調節，在自身免疫性疾病中發揮著重要作用，如下調FoxP3表達，促進IL-17產生，與IL-1協同可促使FoxP3+細胞分泌IL-17，與TGF-β協同可使Treg細胞向Th17細胞轉化[10]，通過STAT3—RORγt信號通路調節Th17細胞。體外細胞學試驗提示，MG患者的Treg細胞功能異常可能與IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A信號通路相關[11]。在重癥肌無力患者或動物模型中，IL-6可調節肌細胞蛋白分解，抗IL-6R抗體可拮抗這種作用[12]，并且下調IL-17、IL-21促炎因子，減少抗-AChR抗體生成，緩解重癥肌無力癥狀[13]。IL-6基因敲除模型動物重癥肌無力癥狀輕于野生型[14]。動物試驗研究提示，抗IL-6抗體治療可以減輕模型動物的肌無力癥狀[15]。結合我們及之前的研究，IL-6與重癥肌無力發病及病情密切相關，可能是未來重癥肌無力治療重要靶點。

在本研究中，重癥肌無力患者血清TGF-β與健康對照組差異無統計學意義，這與一些研究結果[16]是類似的。另外T細胞體外功能檢測也未發現重癥肌無力患者與健康對照組培養液中TGF-β的差異[17]，但也有研究顯示重癥肌無力患者血清TGF-β升高[18]，而另一項研究則發現重癥肌無力患者TGF-β1水平較健康對照組降低，而在給予糖皮質激素治療后升高[19]。在動物模型中，MG動物血清TGF-β1水平與對照組無差異[20]。TGF-β具有抗炎和促炎雙重作用，在自身免疫調節中發揮著重要作用，在IL-6、IL-23存在時，TGF-β可誘導Th17細胞發揮促炎作用，而Treg細胞則通過TGF-β、IL-10、IL-25等細胞因子維持免疫耐受功能[21,22]。此外，TGF-β可能通過下調樹突細胞功能及抑制IL-2分泌、上調Treg細胞功能、增加髓源性抑制細胞等，抑制T、NK細胞增殖、遷移、激活、發揮功能，可抑制細胞毒性CD8+T細胞細胞效應，如穿孔素、顆粒酶B和A、IFN-γ、FAS配體表達等，調節抗體產生，在免疫抑制和免疫耐受中發揮著重要作用[23]。動物試驗表明，地塞米松可抑制TGF-β的表達[18]。骨髓間充質干細胞可通過TGF-β等可溶性分子抑制T細胞及B細胞功能，從而抑制抗-AChR抗體生成[21]。

IL-17家族包括6個亞型(IL-17A,IL-17B,IL-17C,IL-17D,IL-17E,和 IL-17F)，IL-17可誘導IL-6、TNF-α、IL-1β、G-CSF等促炎細胞因子，其過表達被認為與自身免疫疾病相關[14]，自身反應性T細胞具有分泌IL-17、IFN-γ和GM-CSF增多而IL-10減少的特點[2]。在本研究中，未發現重癥肌無力患者血清IL-17與健康對照組存在顯著性差異。有研究顯示，全身型血清IL-17水平顯著高于眼肌型及健康對照組[7]，并且眼肌型重癥肌無力患者血清IL-17高于健康對照[6]，而另外一些研究則提示而眼肌型和健康對照者之間無差異[24]，甚至有研究發現全身型重癥肌無力患者血IL-17水平顯著下降，而在治療后顯著上升[25]。在 MuSK-MG患者研究中發現CD4+T細胞分泌IL-17增加[26]。Meriggioli等[17]發現重癥肌無力患者CD4+CD25high CD127low/Treg細胞功能特別是抑制IL-17、IL-6分泌作用異常。IL-17在體內具有雙重作用，一方面IL-17可促進B細胞產生自身抗體[26]，抗-AChR抗體產生即依賴于IL-17，同時分泌IL-17與GM-CSF的T細胞可誘導自身免疫，另一方面，同時分泌IL-17和IL-10的T細胞則具有維持免疫穩態的作用[27]。模型動物中Th17細胞增多伴IL-17上調與發病相關，IL-17可促進AChR特異性T細胞及產抗-AChR B細胞增殖[28]。有研究者結果發現IL-17基因敲除模型動物重癥肌無力癥狀輕于野生型[14]，并且抗IL-6抗體治療可抑制IL-17基因表達，減輕疾病癥狀[15]。我院重癥肌無力科發現兒童重癥肌無力患者治療后IL-17水平低于治療前，并與臨床癥狀緩解相關[8]。

IL-21是Th17細胞分泌的重要細胞因子之一，可誘導Th2、Th17和Tfh細胞、B細胞、NK細胞分化，并抑制Th1和Treg細胞分化[14,29]，與自身免疫性疾病密切相關，如活動期狼瘡患者血IL-21顯著高于健康對照[30]。IL-21可增加CD8+T細胞和NK細胞的細胞毒作用[29]，降低CD4+CD25+T細胞對CD4+CD25-T細胞的抑制作用，通過STAT3信號通路誘導B細胞分化[29]，拮抗Treg細胞對于外周組織的免疫保護作用[31]。IL-21還可促使B細胞產生IL-10，進而誘導免疫耐受[29]。重癥肌無力患者的IL-21通路可能存在調節異常，其Tfh細胞通過分泌IL-21促進自身抗體生成，在抗-AChR陽性的MG患者中，IL-21不能像在正常人中那樣抑制IL-17A分泌[11]，此外，MuSK陽性MG患者的CD4+T細胞分泌IL-21增加[26]。MG患者血清IFN-γ、IL-17、IL-21要高于健康人，全身型患者血清IL-21高于眼肌型[6]。本研究并未發現重癥肌無力患者血IL-21與健康對照存在差異，這可能與IL-21所具有的雙重作用有關，也可能與入組人群病情較輕有關。

IL-27在自身免疫性疾病中發揮著重要作用，既往研究提示乙酰膽堿受體抗體陽性的重癥肌無力患者血清IL-27顯著高于健康對照，而在免疫球蛋白治療后下降[32]。還有研究進一步分析了不同亞型的重癥肌無力患者血清IL-27水平，發現全身型重癥肌無力患者血清IL-27水平顯著高于眼肌型和健康對照組，胸腺瘤相關重癥肌無力患者顯著高于無胸腺瘤重癥肌無力患者 ，抗-AChR陽性重癥肌無力患者顯著高于抗-AChR陰性患者，但眼肌型及非胸腺瘤相關重癥肌無力患者與健康對照組差異無統計學意義[33]，在該研究中還發現血清IL-27水平與全身型重癥肌無力患者的MG-ADLs評分正相關，免疫球蛋白治療可以顯著降低血清IL-27水平[33]。而在另一項研究中，早發病MG患者血清IL-27水平顯著高于健康對照，而晚發病MG患者血清IL-27則與健康對照水平相近，并且AChR抗體陽性MG患者血清AChR水平與IL-27正相關[34]。但是本研究中與前述研究不同，未發現重癥肌無力患者血清IL-27較健康對照組升高，不同病程及亞型重癥肌無力患者血清IL-27差異無統計學意義。這可能是由于重癥肌無力患者之間較大的異質性及自身免疫性疾病涉及復雜細胞因子調控所致。IL-27由抗原呈遞細胞如樹突細胞、巨噬細胞、單核細胞等分泌，在固有和獲得性免疫中發揮著重要的作用，IL-27具有促炎和抗炎雙重作用，如其既可通過誘導Th細胞分化促進炎癥發展，促進IL-21分泌，誘導Tfh細胞分化并維持其存活[35]，另一方面可抑制Th17細胞功能并誘導IL-10產生[21]，負向調節IL-2、IL-6、IL-27等細胞因子，拮抗IL-6的促炎作用，控制免疫過程，IL-27缺陷小鼠可出現嚴重的T細胞介導致死性免疫應答，給予IL-27可減輕炎癥造成的骨破壞[36]。在胸腺瘤相關的重癥肌無力患者中，IL-27可能通過IL-27/IFN-γ調節環形成正反饋調節，導致胸腺濾泡增生[37]，這可能部分解釋了重癥肌無力患者常伴有胸腺異常的現象。

綜上所述，重癥肌無力患者可能存在著復雜的免疫調控異常，具有顯著的異質性，但包括本研究在內的多數研究提示重癥肌無力患者IL-6通路調節異常，并且IL-6細胞因子通路與多種細胞因子相互作用，可能在重癥肌無力患者免疫調控發揮著關鍵的作用，有望成為新的治療靶點。