血清學(xué)聯(lián)合核酸檢測在承德市無償獻血者血液篩查中的應(yīng)用研究

周靜江 劉明麗

血液輸注能快速補充血容量，改善組織細胞缺血缺氧狀態(tài)，已成為臨床上搶救急性大出血、嚴(yán)重創(chuàng)傷燒傷、器官移植等疾病的主要治療手段，但輸血同時也是導(dǎo)致HIV、HBV、HCV、TP等輸血相關(guān)病原體傳播的重要途徑[1,2]。因此，如何降低經(jīng)輸血傳播HIV、HBV、HCV風(fēng)險，提高輸血安全，已成為采供血機構(gòu)的工作重點和難點。目前，采供血機構(gòu)血清學(xué)輸血傳播病原體篩查項目包括HBsAg、抗-HCV抗體/抗原、抗-HIV抗體/抗原、抗-TP等，但由于檢測試劑窗口期的存在以及靈敏度的限制、獻血者免疫沉默、病毒突變等原因會導(dǎo)致部分陽性標(biāo)本的漏檢[3,4]。核酸檢測(nucleic acid testing,NAT)因其直接檢測病毒體核酸成分，具有較高靈敏度和特異性，能有效縮短HIV，HCV 和 HBV檢測的 “窗口期”，防止低病毒載量標(biāo)本的漏檢，提高血液安全[5,6]。我國2015版《血站技術(shù)操作規(guī)程》明確規(guī)定將 NAT作為采供血機構(gòu)常規(guī)篩查方法及病毒核酸篩查全覆蓋[7]，因此，血清學(xué)聯(lián)合核酸檢測成為各采供血機構(gòu)的常規(guī)病原體篩查模式。為了探究開展血液標(biāo)本核酸檢測對于提高輸血安全的意義，本研究收集承德市中心血站無償獻血者標(biāo)本，分析其免疫血清學(xué)檢測、血清學(xué)聯(lián)合核酸檢測篩查陽性率的不同，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 對象與方法

1.1 調(diào)查對象 選擇承德市中心血站2018年1月至2019年12月采集的77 886份無償獻血者血液樣本作為研究對象。所有獻血者符合《獻血者健康檢查要求》的相關(guān)規(guī)定：體重男≥50 kg，女≥45 kg；90 mm Hg≤收縮壓<140 mm Hg,60 mm Hg≤舒張壓<90 mm Hg；脈搏60次/min～100次/min(高度耐力運動員≥50次/min)；血紅蛋白含量(硫酸銅目測法)男≥1.0520，女≥1.0510；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(干化法)檢查結(jié)果正常；乙型肝炎病毒表面抗原(金標(biāo)法)呈非反應(yīng)性；不具有任何一條獻血禁忌癥。滿足以上指標(biāo)者方能進入采血環(huán)節(jié)。

1.2 儀器與試劑 STAR全自動加樣儀(瑞士HAMILTON公司)，F(xiàn)AME全自動酶免分析系統(tǒng)(瑞士HAMILTON公司),sunrise酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)，ABI7500熒光定量PCR儀、人類免疫缺陷病毒(HIV RNA)-丙型肝炎病毒(HCV RNA)-乙型肝炎病毒(HBV DNA)核酸檢測試劑盒(上?？迫A生物工程股份有限公司),HBsAg檢測試劑盒(上海科華生物工程股份有限公司)、抗-HCV抗原抗體聯(lián)合診斷試劑盒(北京萬泰生物制藥有限公司)、抗-HIV抗原抗體聯(lián)合診斷試劑盒(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司)、抗TP檢測試劑盒(珠海麗珠試劑有限公司)。所有檢測試劑均為國家合格產(chǎn)品且在有效期內(nèi)使用。

1.3 血液標(biāo)本的檢測

1.3.1 血清學(xué)檢測:采用兩種不同廠家的酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒對本血站2018年1月至2019年12月采集的77 886份無償獻血者血液樣本進行HBsAg、抗-HCV抗原/抗體、抗-HIV抗原/抗體、抗-TP的血清學(xué)篩查，檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒操作說明和實驗室的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進行。結(jié)果判讀：初次篩查如兩種ELISA試劑檢測結(jié)果均呈非反應(yīng)性，判定該標(biāo)本為陰性；如均呈反應(yīng)性，判定該標(biāo)本為陽性。如一種檢測試劑呈反應(yīng)性，另一種試劑為非反應(yīng)性，則將該標(biāo)本采用呈反應(yīng)性的檢測試劑進行雙孔復(fù)檢，若結(jié)果顯示單孔或雙孔存在反應(yīng)性，則判定該標(biāo)本的血清學(xué)檢測結(jié)果為單試劑陽性，若雙孔均呈非反應(yīng)性，則判定該標(biāo)本血清學(xué)檢測結(jié)果為陰性。

1.3.2 核酸檢測:采用唐山啟奧軟件信息管理系統(tǒng)Shinow 9.0(唐山啟奧科技有限公司)對無償獻血者血液標(biāo)本的血清學(xué)檢測結(jié)果進行篩查,將血清學(xué)篩查陰性和單試劑陽性標(biāo)本進行病毒核酸檢測。本實驗室采用8∶1核酸混合檢測模式，即將8個血液標(biāo)本混合在一個匯集管內(nèi)，然后再進行病毒核酸的提取、純化，擴增體系的配置，最后采用TaqMan熒光探針PCR擴增技術(shù)對血清學(xué)篩查陰性和單試劑陽性標(biāo)本進行HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA核酸檢測。結(jié)果判讀 ：若核酸混檢呈非反應(yīng)性，則判定標(biāo)本為陰性，如呈反應(yīng)性則進行拆分檢測，拆分結(jié)果若為非反應(yīng)性，判定該標(biāo)本為陰性，如呈反應(yīng)性，則判定標(biāo)本為陽性。注意：核酸標(biāo)本采集后應(yīng)盡快檢測，從采集到完成檢測需<72 h。核酸檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒操作說明和實驗室的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進行。

1.4 觀察指標(biāo) (1)觀察77 886份無償獻血者血液樣本的血清學(xué)結(jié)果： HBsAg、抗-HCV抗原/抗體、HIV抗原/抗體、抗-TP單試劑和雙試劑陽性例數(shù)，計算各檢測項目不合格率以及總體不合格率。(2)比較HBV、HCV、HIV三種檢測項目血清學(xué)篩查陽性率、血清學(xué)與核酸聯(lián)合篩查陽性率的不同。(3)血清學(xué)單試劑陽性標(biāo)本核酸檢測結(jié)果，分析血清學(xué)篩查結(jié)果與核酸篩查結(jié)果的符合率。(4)血清學(xué)篩查陰性標(biāo)本的核酸檢測結(jié)果，分析血清學(xué)篩查試劑的漏檢率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 獻血者標(biāo)本血清學(xué)篩查結(jié)果 經(jīng)兩種不同ELISA試劑檢測共篩查出不合格標(biāo)本752例，不合格率0.966%。其中， HBsAg陽性共228例，包括單試劑陽性184例，雙試劑陽性44例；抗-HCV抗原/抗體陽性共132例，包括單試劑陽性66例，雙試劑陽性66例；HIV抗原/抗體陽性共104例，包括單試劑陽性76例，雙試劑陽性28例；抗-TP陽性共288例，包括單試劑陽性95例，雙試劑陽性193例。見表1。

表1 獻血者標(biāo)本血清學(xué)篩查結(jié)果 例

2.2 獻血者標(biāo)本血清學(xué)篩查陽性率、血清學(xué)聯(lián)合核酸篩查陽性率比較 獻血者標(biāo)本HBV、HCV、HIV血清學(xué)篩查陽性率分別為0.293%、0.169%、0.134%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 54.798，P=0.000)；獻血者標(biāo)本HBV、HCV、HIV血清學(xué)與核酸聯(lián)合篩查陽性率分別為0.311%、0.178%、0.137%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 61.312，P=0.000)。見表2。

表2 獻血者標(biāo)本血清學(xué)篩查陽性率、血清學(xué)聯(lián)合核酸篩查陽性率比較

2.3 血清學(xué)篩查單試劑陽性標(biāo)本的核酸檢測結(jié)果 獻血者標(biāo)本HBV、HCV、HIV血清學(xué)篩查單試劑陽性例數(shù)分別為184例、66例、76例，再經(jīng)核酸檢測呈陽性反應(yīng)例數(shù)分別為2例、0例、3例。血清學(xué)篩查試劑與核酸檢測試劑篩查陽性符合率分別為1.09%、0、3.95%。見表3。

表3 血清學(xué)篩查單試劑陽性標(biāo)本的核酸檢測結(jié)果

2.4 血清學(xué)篩查陰性標(biāo)本的核酸檢測結(jié)果 77 886例獻血者標(biāo)本經(jīng)兩種不同廠家血清檢測試劑HBV、HCV、HIV篩查，呈非反應(yīng)性的標(biāo)本例數(shù)分別為77 658例、77 754例、77 782例，陰性標(biāo)本再經(jīng)HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA核酸檢測呈反應(yīng)性樣本例數(shù)分別為14例、7例、3例，血清學(xué)試劑篩查漏檢率分別為 0.018%、0.009%、0.004%，三者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 7.771，P=0.021)。見表4。

表4 血清學(xué)篩查陰性標(biāo)本的核酸檢測結(jié)果

3 討論

降低輸血相關(guān)病毒傳播風(fēng)險，提高輸血安全，已經(jīng)成為采供血機構(gòu)、醫(yī)療行業(yè)甚至全社會關(guān)注的焦點。因此，如何提高陽性標(biāo)本檢出率、降低經(jīng)輸血傳播病毒殘余風(fēng)險目前已成為各采供血機構(gòu)持續(xù)改進的工作重點和難點。酶聯(lián)免疫吸附試驗是我國采供血機構(gòu)普遍使用的血液篩查技術(shù)，尤其隨著近幾年ELISA檢測試劑的不斷更新?lián)Q代，其穩(wěn)定性的不斷提高，實驗室血清學(xué)篩查技術(shù)在在降低經(jīng)血HBV、HCV、HIV等病原體傳播，保障輸血安全上更是發(fā)揮著重要作用。盡管ELISA檢測試劑的靈敏度經(jīng)過不斷改進，得到很大提高，但仍然無法避免病毒檢測窗口期的存在，HBV窗口期為56 d、HCV為72 d、HIV為22 d，加之病毒亞型、病毒變異、患者免疫沉默等情況的存在，必然會導(dǎo)致弱陽性標(biāo)本尤其是窗口期標(biāo)本的漏檢[8]，這給輸血安全帶來嚴(yán)重威脅。此外，ELISA檢測試劑的低特異性，也會導(dǎo)致假陽性結(jié)果的增加，獻血者獻血資格的淘汰，這不僅浪費了寶貴的血液資源，同時也對獻血者的獻血愛心帶來不利影響。核酸擴增技術(shù)是直接檢測病毒核酸的一系列技術(shù)的總稱，該檢測技術(shù)具有高度的靈敏度和特異性。研究表明：對無償獻血者血液標(biāo)本進行核酸檢測，可將HBV、HCV、HIV的感染窗口期分別縮短至為41 d、12 d和11 d[9,10]，并可防止低病毒載量標(biāo)本及隱匿性乙型肝炎感染(occult HBV infection,OBI)的漏檢[11,12]。我國于2016年實現(xiàn)無償獻血核酸檢測全覆蓋。目前，國內(nèi)采供血機構(gòu)的核酸檢測模式主要有混樣檢測和單人份檢測兩種模式，混樣檢測一般在去除血清學(xué)篩查陽性標(biāo)本后進行，單人份檢測一般與血清學(xué)檢測同時進行。承德市中心血站采用8人份混樣模式對獻血者標(biāo)本進行核酸檢測。本研究通過觀察承德市中心血站獻血者標(biāo)本免疫血清學(xué)檢測陽性率、血清學(xué)聯(lián)合核酸檢測篩查陽性率的不同，分析核酸檢測對于提高血液安全，降低輸血風(fēng)險的重要意義。

HBV、HCV、HIV是我國采供血機構(gòu)常規(guī)病原體篩查項目，本研究的77886無償獻血者標(biāo)本經(jīng)HBV、HCV、HIV血清學(xué)篩查呈陽性反應(yīng)標(biāo)本例數(shù)分別 228例、132例、104例、篩查陽性率分別為0.293%、0.169%、0.134%， 血清學(xué)聯(lián)合核酸檢測陽性率分別為0.311%、0.178%、0.137%，HBV、HCV、HIV的篩查陽性率均呈現(xiàn)HBV>HCV> HIV的趨勢，這與我國人群HBV、HCV、 HIV三種病毒的流行率相吻合，與劉麗等[13,14]的研究得出的HBV、HCV、HIV陽性率趨勢也一致。

檢測試劑的靈敏度決定真陽性標(biāo)本的檢出率，而特異性決定真陰性標(biāo)本的檢出率，對于靈敏度和特異性均較高的試劑既可以降低真陽性標(biāo)本的漏檢，又可以避免真陰性標(biāo)本的誤診。近幾年，血清學(xué)檢測試劑通過改進其靈敏度和特異性不斷提高，核酸檢測因其高特異性和靈敏度曾被作為血液篩查的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究中，血清學(xué)篩查單試劑陽性的184例HBV、66例HCV、76例HIV獻血者標(biāo)本再經(jīng)核酸檢測呈陽性反應(yīng)例數(shù)分別為2例、0例、3例。血清學(xué)篩查試劑與核酸檢測試劑篩查陽性符合率分別為1.09%、0、3.95%。推測可能是因為血清學(xué)檢測試劑靈敏度高而特異性太低，導(dǎo)致出現(xiàn)大量假陽性標(biāo)本，經(jīng)高特異性的核酸檢測試劑檢測呈陰性結(jié)果。提示：應(yīng)進一步提高血清學(xué)檢測試劑的特異性，防止出現(xiàn)大量假陽性結(jié)果，導(dǎo)致無償獻血者獻血資格的淘汰，獻血人群的流失。

本研究中，77886例獻血者標(biāo)本經(jīng)HBV、HCV、HIV血清學(xué)篩查呈非反應(yīng)性者分別為77 658例、77 754例、77 782例，這些血清學(xué)檢測陰性標(biāo)本經(jīng)核酸檢測呈反應(yīng)性樣本例數(shù)分別為14例、7例、3例。這說明HBV、HCV、HIV三種核酸檢測試劑均存在陽性標(biāo)本漏檢情況。如果這些漏檢標(biāo)本被發(fā)往臨床，必然給輸血安全和患者的生命健康帶來嚴(yán)重威脅，因此應(yīng)進一步提高血清學(xué)試劑的檢測靈敏度，降低弱陽性標(biāo)本的漏檢。同時此結(jié)果也說明：通過核酸檢測可彌補血清學(xué)檢測的不足，提高陽性標(biāo)本的檢出率，降低漏檢率，進一步提高血液安全。這與其他多項核酸與血清學(xué)聯(lián)合檢測相關(guān)研究的結(jié)果[15-17]一致。

此外，我們的研究結(jié)果還顯示：HBV、HCV、HIV三種血清學(xué)試劑篩查漏檢率分別為 0.018%、0.009%、0.004%，具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。這種差異除了與病毒在獻血人群的流行率不同有關(guān)外，還與HBV、HCV、HIV三種血清學(xué)篩查試劑的靈敏度密切相關(guān)。不同的 ELISA 試劑生產(chǎn)廠家包被的抗原、抗體片段以及酶標(biāo)抗體的濃度均不同，這必然會導(dǎo)致各檢測試劑靈敏度的差異。本研究中HCV和HIV的血清學(xué)漏檢率均低于HBV，推測一方面是因為HCV和HIV在獻血人群中的流行率低于HBV，另一方面是因為HCV和HIV血清學(xué)篩查試劑均為抗原抗體聯(lián)合檢測，縮短了窗口期，提高了弱陽性標(biāo)本的檢出，而HBV血清學(xué)篩查試劑只檢測乙肝病毒表面抗原。

通過本研究表明：在無償獻血者標(biāo)本血清學(xué)篩查的基礎(chǔ)上，開展核酸檢測，可降低窗口期和弱陽性標(biāo)本的漏檢，提高檢測準(zhǔn)確性和血液質(zhì)量，降低輸血傳播病原體的風(fēng)險。同時，應(yīng)進一步提高血清學(xué)篩查試劑靈敏度和特異性，降低血液標(biāo)本的漏檢率和誤診率。