燈盞細辛對人脈絡膜黑色素瘤細胞凋亡的影響及作用機制

李鑫，陳娜，林文娟，袁媛

脈絡膜黑色素瘤（choroidal melanoma，CM）多見于40～60 歲人群，屬于成人最常見的原發性眼內惡性腫瘤。該病病因未明，可能與內分泌、環境、病毒感染、遺傳因素有關[1-2]。CM 屬于惡性腫瘤，發展迅速，具有較高的轉移率，主要采取眼球摘除方法治療但對于遠處轉移的CM 患者，尚無有效治療方法[3-4]。因此，尋找一種療效好、副作用小、安全性高的治療藥物迫在眉睫。燈盞細辛具有抑制氧化反應、降血脂、殺菌消毒、抗腫瘤等藥理作用[5-6]。以往關于燈盞細辛對眼組織保護作用的研究大都集中在動物體內模型[7-8]，因此，本研究擬在細胞水平進一步研究燈盞細辛對CM 細胞凋亡的促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人眼侵襲性CM 細胞系OCM-1（美國ATCC 公司，批號：DSM 4855），98%燈盞細辛注射液（武漢博士德生物工程有限公司，批號：20150112），二甲基亞砜、胎牛血清、達爾伯克改良伊格爾培養基培養液(dulbecco’s modification of eagle’s medium dulbecco，DMEM）、CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：KGA317），4%多聚甲醛（北京百奧萊博科技有限公司，批號：BTN131248），0.1%胰酶（北京索萊寶生物公司，批號：P7340），Hoechst 33258 染色試劑盒（南京建成生物研究所，批號：G003-1-2），Annexin-V 和PI 試劑盒（北京索萊寶生物公司，批號：CA1020），雙辛酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白測定試劑盒、聚氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（上海碧云天公司，批號：P0010S；FFP24），Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）及B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（上海碧云天公司，批號：AF0057；P7257），酶標儀（北京中西華大科技有限公司，型號：M399038），流式細胞儀（美國BD公司，型號：DLK0002563），電泳儀（北京恒奧德儀器儀表有限公司，型號：HAD-JY600C），熒光顯微鏡（上海無陌光學儀器有限公司，型號：WMF-3530LED）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 在含10%胎牛血清的DMEM 培養基（青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL）中培養OCM-1 細胞，培養箱內溫度為37℃，CO2體積分數為5%，每3 d 傳代1 次，更換新鮮培養液，取對數期生長的細胞進行實驗，細胞密度達到80%左右，用胰酶消化進行實驗。

1.2.2 細胞分組 接種于96 孔板中，共分4 組，每組5 個復孔。（1）對照組（NC 組）：正常培養液培養細胞。（2）燈盞細辛組：以燈盞細辛濃度不同分為3 個亞組。燈盞細辛低濃度組（LC 組），即在培養基中加入1 μmol/L 的燈盞細辛溶液；燈盞細辛中濃度組（MC 組），即在培養基中加入10 μmol/L 的燈盞細辛溶液；燈盞細辛高濃度組（HC 組），即在培養基中加入100 μmol/L 的燈盞細辛溶液。每組均培養48 h。

1.3 CCK-8 法檢測OCM-1 細胞增殖率

OCM-1 細胞接種于96 孔培養板中，按照上述方法隨機分4 組，100 μL/孔，培養箱中培養48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，在37℃恒溫箱中孵育1 h，用酶標儀檢測450 nm 光密度（optical density，OD）值。

1.4 Hoechst 33258 染色法檢測凋亡

細胞接種于12 孔板中，調整細胞密度至5×104個/mL，4%多聚甲醛固定細胞10 min，去固定液并用PBS 沖洗2 次，PBS 洗滌時手動晃動數次。加入Hoechst 33258 染色液后室溫避光反應10 min，PBS 洗滌2 次后，再超凈臺中避光風干，倒置熒光顯微鏡下觀查并拍照。

1.5 應用Annexin V/PI 染色劑進行流式細胞技術檢測凋亡

OCM-1 細胞接種于6 孔板中，0.1%胰酶（不含乙二胺四乙酸）消化各組細胞后制備細胞懸液。1000 r/min 離心后，收集細胞并轉移至含有300μL 緩沖液的離心管中，分別加入5μLAnnexin-V 和10μLPI溶液，室溫下避光反應30min 后上機檢測細胞凋亡率。

1.6 Western blot 法檢測OCM-1 細胞內Bax 及Bcl-2 的蛋白表達

提取蛋白質后行聚丙烯酰胺凝膠電泳，設置一抗稀釋濃度為1:1000，二抗稀釋濃度為1:2000，電化學發光法顯影，統計學分析結果以樣本目的蛋白的OD 比內參條帶的OD，計算相對表達率。

1.7 統計學方法

用SPSS18.0 統計學軟件分析數據。計量資料用均值±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OCM-1 細胞的增殖率比較

4 組間比較，差異有統計學意義（F=6.453，P=0.014）。與NC 組比較，各組均明顯降低，差異有統計學意義（tLC=8.806，tMC=9.293，tHC=12.832，均P=0.000）。與LC組比較，MC 組降低不明顯，差異無統計學意義（t=1.783，P=0.112）；HC 組明顯降低，差異有統計學意義（t=5.639，P=0.000）。HC 組比MC 組明顯降低，差異有統計學意義（t=4.214，P=0.000）（表1）。

表1 4 組OCM-1 細胞的增殖率、凋亡率、Bax 和Bcl-2 比較（，n=5）

表1 4 組OCM-1 細胞的增殖率、凋亡率、Bax 和Bcl-2 比較（，n=5）

注：NC 組 對照組；LC 組 燈盞細辛低濃度組；MC 組 燈盞細辛中濃度組；HC 組 燈盞細辛高濃度組；* 與NC 組比較，P＜0.05；# 與LC 組比較，P＜0.05；△與MC 組比較，P＜0.05

2.2 OCM-1 細胞的凋亡比較

Hoechst 33258 染色劑可以進入凋亡細胞的細胞核，在熒光顯微鏡下，表現為致密顆粒狀強熒光集聚（亮藍色高熒光），以HC 組最為明顯（圖1）。

圖1 OCM-1 細胞凋亡圖（×200）。1A 對照組，可見均勻一致的暗黑色背景；1B 燈盞細辛低濃度組，可見高熒光類圓形細胞核，為凋亡細胞；1C 燈盞細辛中濃度組，可見高熒光類圓形細胞核數量增加；1D 燈盞細辛高濃度組，可見彌漫分布的凋亡細胞

流式細胞技術結果顯示，4 組間凋亡率比較差異有統計學意義（F=9.440，P=0.003）。與NC 組比較，各組均明顯升高，差異有統計學意義（tLC=7.760，tMC=9.776，tHC=14.650，均P=0.000）。與LC 組比較，MC 組升高不明顯，差異無統計學意義（t=0.535，P=0.607），HC 組升高明顯，差異有統計學意義（t=11.140，P=0.000）。HC 組比MC 組明顯升高，差異有統計學意義（t=11.020，P=0.000）（表1）。

2.3 Bax 及Bcl-2 蛋白的表達比較

4 組間Bax 相對表達量比較，差異具有統計學意義（F=5.114，P=0.012）。與NC 組比較，各組均升高，差異均有統計學意義（tLC組=10.750、tMC組=20.813、tHC組=81.881，均P=0.000）。與LC 組比較，MC 組降低，HC組升高，差異均有統計學意義（tMC=17.48，tHC=19.433，均P=0.000）。HC 組比MC 組升高，差異有統計學意義（t=3.680，P=0.006）（表1、圖2）。

4 組間Bcl-2 相對表達量比較，差異有統計學意義（F=5.694，P=0.010）。與NC 組比較，各組均降低，差異均有統計學意義（tLC=4.648，P=0.002；tMC=6.197，tHC=14.334，均P=0.000）。與LC 組比較，MC 組和HC組均降低，差異均有統計學意義（tMC=3.043，P=0.016，tHC=9.767，P=0.000）。HC 組比MC 組降低，差異有統計學意義（t=7.267，P=0.000）（表1、圖2）。

圖2 OCM-1 細胞內Bax 及Bcl-2 蛋白表達變化圖

3 討論

CM 始發于脈絡膜大血管層，可以發生于脈絡膜的任何部位，但常見于眼的后極部。如果瘤體生長于周邊部眼底，患者可無明顯癥狀；如瘤體生長于后極部，則表現為屈光度數增加、視物變形、視力下降、視野缺損，瘤體增大并繼發視網膜脫離時視力嚴重下降[9-10]。CM 發病機制并不明確，治療方案存在很大爭議，手術輔以放療和化學藥物治療是主要方法[11]。

對于腫瘤疾病，采用新的藥物誘導細胞凋亡來治療腫瘤疾病已經成為研究熱點[12]。燈盞細辛為菊科植物短葶飛蓬全草的主要活性成分，具有天然、低毒、高效、價格低廉的特征[5-6]。李奕萍[13]通過觀察銀杏葉提取物聯合燈盞細辛對青光眼小梁切除術后患者療效，發現兩者聯合應用可以有效提高青光眼患者術后視力水平，改善視野并降低眼內壓。本研究考察了燈盞細辛對OCM-1 細胞的細胞毒作用及其作用機制。CCK-8 結果顯示，燈盞細辛抑制了OCM-1細胞的生長，且有濃度依賴性。判斷細胞凋亡最直觀方法為細胞形態學觀察。Hoechst 33258 核染色法直接顯示了燈盞細辛能夠誘導OCM-1 細胞凋亡。此外，Annexin V/PI 檢測結果從另一個角度認證了燈盞細辛對OCM-1 細胞凋亡的促進作用。

細胞凋亡具有復雜的分子生物學特征，涉及一系列基因的表達、調控及激活，從而使機體更好的適應生存環境。細胞凋亡過程中清除了異常細胞，保證了生物體內環境的穩定，為促進系統發育發揮作用[14]。多種因素（衰老、藥物、氧化損傷、射線）能夠誘發凋亡反應，當機體正常的凋亡過程受到破壞或凋亡過程紊亂時，引發多種疾病，例如自身免疫性疾病及腫瘤[15]。本實驗除了通過觀察燈盞細辛對OCM-1細胞增殖率、凋亡率的影響，還進一步從機制學方面探討了燈盞細辛的作用機理。Bcl-2 家族是線粒體凋亡途徑中的重要調節因素，其中，Bcl-2 屬于抗凋亡基因，Bax 屬于促凋亡基因，通過調節線粒體膜的通透性誘導細胞凋亡[16]。本研究發現，燈盞細辛誘導了OCM-1 細胞Bax 蛋白表達上調，Bcl-2 蛋白表達下調。

綜上所述，燈盞細辛通過改變線粒體凋亡途徑中凋亡相關信號分子Bax 及Bcl-2 的表達，濃度依賴性的抑制了OCM-1 細胞的生長并促進細胞凋亡，有望成為臨床上治療CM 的有效藥物。