高效液相色譜柱后衍生法測定啤酒中甲醛含量

曾文祥，李珍妮，曾 川，鐘 敏

（1.拱北海關技術中心，廣東珠海 519000；2.廣東藥科大學，廣東中山 528400）

甲醛，化學式HCHO，又稱蟻醛，是無色有刺激性氣體，易溶于水和揮發于空氣中，對人體眼鼻等有刺激性，長時間接觸高濃度的甲醛容易致癌，已被世界衛生組織國際癌癥研究機構列為一類致癌物[1]。近年來經常有報料食品中檢出甲醛的新聞，食品中甲醛的來源廣泛，主要有：①不良商家將甲醛添加至食品中用于保鮮；②甲醛是細胞生理代謝的正常產物，許多天然食品自身產生甲醛本底，如水產品及水發產品中的牛百葉、魷魚、銀耳等[2]；③食品生產過程中產生甲醛，如食品發酵。啤酒作為發酵食品，甲醛又是細胞代謝的正常產物，所以啤酒在生產過程中或有少量甲醛產生，《食品安全國家標準 發酵酒及其配制酒》（GB 2758—2012）規定啤酒中甲醛含量應≤2.0 mg/L[3]，故對啤酒進行甲醛檢測，顯得十分必要。目前啤酒中甲醛含量的檢測方法主要為GB/T 5009.49—2008乙酰丙酮紫外分光光度法[4]，該方法需要對啤酒樣品進行蒸餾除雜，蒸餾過程容易損失甲醛，導致結果偏低；同時甲醛與乙酰丙酮衍生產物不穩定，當樣品數量比較多，或者實驗員測定衍生產物吸光度速度不夠快時，會導致前后樣品從開始衍生到測定紫外吸光度時間差異較大，導致定量結果不準確。針對上述問題，參照《化妝品安全技術規范》（2015版）4.9節化妝品中游離甲醛的檢測方法[5]，開發出高效液相色譜柱后衍生法測定啤酒中甲醛含量方法，相對于GB/T 5009.49—2008乙酰丙酮紫外分光光度法，本方法具有前處理時間更短、無需蒸餾、回收率更高、重現性更好、利用色譜柱分離，樣品雜質干擾更少等優點。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1260高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器）；Pickering柱后衍生儀；不同牌子啤酒市購；甲醛標準溶液：1 000 mg/L。試驗所用試劑及配制：10%磷酸溶液，取1 mL磷酸溶液，用水定容至10mL；衍生化溶液，稱取62.5 g乙酸銨，7.5 mL冰乙酸，5 mL乙酰丙酮，加水至1 000 mL。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：Symmetry?C18（5 μm×250 mm×4.6 mm）；流動相：0.2%磷酸溶液等度洗脫；流量：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：50 μL；檢測波長：420 nm；柱后衍生儀衍生液流速：0.5 mL/min；柱后衍生反應器溫度80 ℃。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準點溶液配制

取甲醛標準溶液，用水稀釋成1 mg/L和10 mg/L，分別取稀釋后的甲醛標準溶液適量于10 mL比色管中，加入0.2 mL 10%磷酸溶液，用水定容，配成濃度0 mg/L、0.01 mg/L、0.025 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L和5.0 mg/L標準系列溶液，上機測定。

1.3.2 樣品處理

準確移取0.5 mL樣品于10 mL比色管中，加入0.2 mL 10%磷酸溶液，用水定容，過0.45 μm濾膜作為待測溶液，上機測定。

2 結果與分析

2.1 方法專屬性

濃度為0 mg/L（試劑空白）的標準點色譜圖目標峰（保留時間5.13 min）附近未出現干擾峰（圖1），方法專屬性良好。

圖1 濃度為0 mg/L標準溶液色譜圖

2.2 方法檢出限與定量限

分別配制濃度為1.0 mg/L、0.5 mg/L、0.2 mg/L、0.1 mg/L、0.05 mg/L、0.025 mg/L、0.01 mg/L、0.005 mg/L和0 mg/L標準溶液系列，上機測定，用儀器軟件計算信噪比（計算模式6SD，選取色譜5.5～7.5 min作為基線噪音），信噪比結果見表1。

表1 不同標液濃度信噪比

試驗結果顯示濃度為0 mg/L色譜圖無目標峰，濃度0.01 mg/L的信噪比為6.3，濃度0.025 mg/L的信噪比為12.8，綜合色譜圖基線情況，分別擬取0.01 mg/L、0.025 mg/L作為本方法儀器檢出限、定量限，對應方法的檢測限和定量限分別為0.2 mg/L、0.5 mg/L。

移取0.5 mL樣品，平行測定3次，實驗結果顯示空白樣品甲醛含量低于檢出限（0.076 5 mg/L）；另移取0.5 mL樣品，分別按照方法檢出限0.2 mg/L和方法定量限濃度0.5 mg/L，加入甲醛標液，進行加標實驗，平行測定6次，扣除樣品空白后，計算回收率及變異系數，檢出限加標平均回收率為105.9%，變異系數為7.80%（表2）；定量限加標回收率為102.4%，變異系數為3.89%（表3）。樣品空白及樣品定量限濃度加標實驗色譜圖如圖2、圖3所示。

圖2 樣品空白色譜圖

圖3 方法定量限（0.5 mg/L）加標色譜圖

表2 方法回收率、精密度（n=6）

2.3 標準曲線

配制濃度0 mg/L、0.01 mg/L、0.025 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L和5.0 mg/L標準系列溶液，上機測定，以甲醛濃度為橫坐標，甲醛衍生物的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。甲醛濃度在0.01～5 mg/L與之對應衍生物峰面積呈線性，線性方程為y=462.237 053x+1.683 071 8，相關系數為1.000。

2.4 方法準確度考察

取未檢出甲醛（＜0.2 mg/L）的空白樣品0.5 mL，分別按照方法定量限、GB 2758—2012甲醛判定限量、10倍判定限量即0.5 mg/L、2.0 mg/L、20.0 mg/L濃度水平進行加標試驗，平行試驗6次，扣除樣品空白，計算平均回收率和RSD，試驗結果顯示（見表3）回收率在95.8%～102.4%，RSD在0.70%～3.89%，本方法準確度良好。

表3 方法準確度考察（n=6）

2.5 柱后衍生反應器溫度考察

配制濃度為1 mg/L的標準溶液，分別將柱后衍生儀反應器溫度設為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃和 120 ℃，每個設定溫度下，重復進樣3次，并計算平均峰面積。以溫度為橫坐標，平均峰面積為縱坐標，繪制曲線圖（圖4）；實驗顯示衍生物峰面積隨衍生溫度升高而變大，90 ℃衍生物峰面積達到最大，但與80 ℃差別不大，100～120 ℃衍生物峰面積有輕微變小，綜合考慮衍生物峰面積和溫度太高對儀器和衍生管路的影響，本方法以80 ℃作為柱后衍生儀反應器溫度。

圖4 柱后衍生反應器溫度與衍生物峰面積關系

2.6 取樣量對檢測結果影響考察

取未檢出甲醛（＜0.2 mg/L）的空白樣品適量于100 mL比色管中，加入0.2 mL濃度為1 000 mg/L的甲醛標液，用空白樣品定容至刻度，制成濃度為2 mg/L加標樣品。分別取加標樣品0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL和8.0 mL于10 mL比色管中進行試驗，按試驗方法平行測定3次，計算3次平均回收率，以取樣量為橫坐標，平均回收率為縱坐標，繪制曲線圖（圖5），試驗顯示當取樣量為0.5 mL時，加標回收率最高96.7%，當增加取樣量時，加標回收率降低，當取樣量低于0.5 mL時加標回收率稍微偏低，可能是取樣量太少，上機濃度太低導致加標回收率偏低，故將0.5 mL確定為本方法取樣量。

圖5 不同取樣量與加標回收率關系

2.7 樣品分析

按試驗方法，對多種品牌啤酒進行空白樣品檢測，及判定限量2 mg/L濃度水平加標實驗，實驗結果顯示各品牌的啤酒甲醛含量均為未檢出（＜0.2 mg/L），甲醛含量均符合國家要求，2 mg/L水平加標回收率在92.3%～102.1%，說明本方法適用大多數品牌啤酒中甲醛含量測定，方法專屬性強。

3 結論

本方法采用高效液相色譜分離出樣液中的甲醛，再經過柱后衍生儀，在線與乙酰丙酮反應，在420 nm波長下紫外檢測器檢測，經過試驗驗證，儀器最低響應濃度為0.01 mg/L，方法檢出限和定量限分別為0.2 mg/L、0.5 mg/L，各濃度水平加標回收率及RSD（n=6）均滿足檢測分析要求，確定了衍生器反應溫度為80 ℃，最佳取樣量為0.5 mL；本方法適用于市面上大多數品牌啤酒甲醛含量檢測，各品牌啤酒2 mg/L濃度水平加標回收率在92.3%～102.1%。與GB/T 5009.49—2008方法相比，本方法只需取0.5 mL樣品定容至10 mL和配制標準點溶液上機即可，樣品前處理更加簡便，無需蒸餾凈化樣品，同時確保了每個樣品衍生化時間一致，檢測結果精密度更高。