HPLC法測定陜北地區(qū)甜菊葉中甜菊糖苷含量

祁春雷，劉月霞，高 強(qiáng)，文 鈺

（榆林合力生物科技有限公司，陜西榆林 719000）

甜菊葉屬菊科，又名甜菊葉、甜草，是一種多年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲巴拉圭巴西交界的阿曼山脈。甜菊糖是從甜菊葉中提取出的含甜菊苷、瑞鮑迪苷A、瑞鮑迪苷B等9種甜味成分的四環(huán)二萜類化合物，其中，瑞鮑迪苷A甜菊苷含量最高，甜味品質(zhì)最好，甜度是蔗糖甜度250～350倍，而熱量僅為蔗糖的1/300。2008年末甜菊糖被美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)使用，被譽(yù)為世界“第3類糖源”[1]。甜菊糖苷因其甜度高、熱量低、無毒性、耐高溫、耐酸堿和水溶性好，攝入人體后不被吸收，不產(chǎn)生熱量等優(yōu)點(diǎn)，被稱為是天然、健康的新型無熱量代糖產(chǎn)品，是糖尿病和肥胖病患者適用的甜味劑。可用于糖果、糕點(diǎn)、飲料、固體飲料、油炸小食品、調(diào)味料和蜜餞等食品加工領(lǐng)域。

目前關(guān)于甜菊葉中甜菊糖苷的測定方法有質(zhì)量法、堿量法、分光光度法和薄層色譜法等。本試驗(yàn)擬采用高效液相色譜法對佳縣、定邊、米脂3個(gè)產(chǎn)地的甜菊葉樣品進(jìn)行甜菊糖苷檢測，并分析甜菊葉里甜菊糖苷混合物中不同甜菊糖苷的含量，以期為甜菊葉質(zhì)量評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3份相同品種甜菊葉樣品采于佳縣、米脂、定邊等地的農(nóng)業(yè)企業(yè)或種植基地。乙腈、磷酸二氫鈉、磷酸，均為色譜純。磷酸鈉緩沖液（pH2.6）：稱取1.20 g磷酸二氫鈉（NaH2PO4），溶于800 mL水中，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.6。流動(dòng)相：乙腈-磷酸鈉緩沖液(30∶70，體積比)。

甜菊苷標(biāo)準(zhǔn)品：甜菊苷含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以干基計(jì))≥99.0%。瑞鮑迪苷A標(biāo)準(zhǔn)品：瑞鮑迪苷A含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以干基計(jì))≥99.0%。其他7種糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以干基計(jì)）≥99.0%：瑞鮑迪苷B、瑞鮑迪苷C、瑞鮑迪苷D、瑞鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷和甜菊雙糖苷。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(日本島津公司產(chǎn)品)；紫外檢測器；電子天平；超聲波清洗儀(上海杰理科技有限公司產(chǎn)品)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

C18反相色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈：磷酸鈉緩沖液=30∶70，梯度洗脫，流速1 mL/min；柱溫40 ℃；紫外檢測器波長為210 nm，進(jìn)樣量 10 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

將甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品置于105 ℃干燥箱中烘2 h，精密稱取5 mg，溶液溶解并定容至10 mL，搖勻置于棕色瓶中。即配成濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。吸取10 μL標(biāo)液進(jìn)樣，并記錄。

1.3.3 供試樣品溶液的制備

將3份甜菊葉樣品置于105 ℃干燥箱中烘2 h，粉碎后分別稱取1 g放入燒杯中加入100 mL純凈水置于超聲波清洗器中60 ℃超聲提取1 h，高速離心20 min，收集過濾液并經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，得到備用樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取上述佳縣供試樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣3次，進(jìn)樣量為10 μL，記錄峰面積，計(jì)算甜菊苷（Stevioside，ST）、瑞鮑迪苷A（Rebaudioside A，RA）、瑞鮑迪苷B（Rebaudioside B，RB）、瑞鮑迪苷C（Rebaudioside C，RC）、瑞鮑迪苷D（Rebaudioside D，RD）、瑞鮑迪苷F（Rebaudioside F，RF）、杜克苷A（DulcosideA，DA）、 甜 茶 苷（Rubusoside，RUB）和 甜 菊 雙 糖苷（Steviolbiosid，SB）的 相 對 標(biāo) 準(zhǔn) 偏 差（Relative Standard Deviation，RSD）值分別為2.15%、2.23%、1.98%、2.13%、2.02%、1.89%、1.99%、2.10%和2.11%，表明HPLC法測定甜菊糖苷含量精密度良好[2]。

2.2 甜菊葉中甜菊糖苷含量

佳縣、定邊、米脂甜菊葉中甜菊糖苷的色譜圖如圖1～圖3所示，具體含量見表1。甜菊葉中ST和RA含量占甜菊糖苷總量的比例是評價(jià)甜菊葉質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)。表1結(jié)果顯示，3個(gè)地區(qū)的總苷含量在15.20%～17.51%，其中米脂的總苷含量最高，定邊的總苷含量最低[3]。不同地區(qū)各種成分含量差別比較大的是RA含量和RUB含量，其中，RA含量米脂最高、佳縣次之、定邊最低；RUB含量米脂最高、定邊次之、佳縣邊最低，米脂的RUB含量是佳縣的4 倍[4]。

圖1 佳縣甜菊葉色譜圖

圖2 定邊甜菊葉色譜圖

圖3 米脂甜菊葉色譜圖

表1 不同地區(qū)甜菊葉中甜菊糖苷的含量

影響甜菊葉中甜菊糖苷含量的主要因素是溫度、光照、生長周期[5]。定邊甜菊葉種植在風(fēng)力發(fā)電設(shè)備下，種植基地相對于佳縣和米脂海拔高、溫度低，導(dǎo)致甜菊葉的生長周期縮短，RA含量和總苷含量較低。而米脂種植基地在太陽能發(fā)電光板下，地勢平坦、溫度較其他兩地高，但光照不足，影響了甜菊葉的質(zhì)量。佳縣是大面積、大規(guī)模平地種植，正常光照和溫度，其RA占總苷含量最高。

3 結(jié)論

HPLC法測定甜葉菊中甜菊糖苷含量精密度良好，且能同時(shí)測定甜葉菊中甜菊糖苷總量及9種成分，包括甜菊苷、瑞鮑迪苷A、瑞鮑迪苷B、瑞鮑迪苷C、瑞鮑迪苷D、瑞鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷、甜菊雙糖苷的含量，為不同地區(qū)甜葉菊質(zhì)量評價(jià)提供了一種操作簡便、高效快速的檢測方法。