液相色譜串聯質譜法測定豆芽中2種植物生長調節劑

崔 敏

（榮成市檢驗檢測中心，山東榮成 264300）

豆芽是餐桌上常見的美食，含有蛋白質、維生素和粗纖維等豐富的營養物質，具有補充人體所需氨基酸、降低膽固醇、促進腸胃蠕動和消腫利尿等作用，深受人們喜愛[1-3]。近年來，不法商販為了縮短豆芽的生長周期和增加產量，在加工過程中使用了植物生長調節劑，促進植物細胞分裂、生長以及豆芽下胚軸增粗，抑制軸長和根部萌發，以達到加粗豆芽頸部生長的目的[4-6]。人們食用后，能引起惡心、嘔吐等胃部不良反應，損害人體皮膚、食道、胃黏膜等，給人們的身體健康造成巨大危害[7-9]。市場監督管理局、農業部、國家衛生和計劃生育委員會發布了《關于豆芽生產過程中禁止使用6-芐基腺嘌呤等物質的公告》（2015年第11號），明確規定在豆芽生產過程中禁止使用4-氯苯氧乙酸和6-芐基腺嘌呤等物質[10]，并將其列為食品監管領域重點工作，在每年的國家食品安全監督抽檢實施細則中均有體現。基于豆芽中植物生長調節劑的測定（BJS 201703）方法[11]，采用QuEChERS離心管凈化樣品時，會損失部分樣品提取液，影響試驗準確度，因此本研究建立了LC-C18固相萃取柱凈化法，凈化提取液時抽干萃取柱，損失極少，且操作簡單快速，能夠準確測定豆芽中4-CPA和6-BAP的含量。

1 試驗部分

1.1 試劑與藥品

4-CPA和6-BAP為有證標準物質（北京壇墨質檢科技股份有限公司）；甲醇、乙腈（歐普森（Oceanpak）色譜純）；甲酸、乙酸銨、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉（國藥集團化學試劑北京有限公司）；實驗室用水符合GB/T 6682規定的一級水。

1.2 儀器與設備

三重四級桿液相色譜-串聯質譜儀：TSQ Quantum Ultra EMR System，美國賽默飛世爾科技公司；電子分析天平：AR224CN，±0.000 1 g，上海天平儀器廠；高速冷凍離心機：CF16RXⅡ，日本日立；全自動均質器：AH-40，睿科；渦旋混合器：Vortex I，IKA；氮吹儀：MTN-5800，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；超純水系統：重慶摩爾水處理設備有限公司的MOL PW500EDI；C18色譜柱：thermo，hypersil gold（C18） 100 mm×2.1 mm，1.9 μm；LC-C18固相萃取柱：CNW，6 mL/500 mg。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液的配制

（1）混合標準中間液的配制。4-CPA標準溶液和6-BAP標準溶液，含量均為100 μg/mL，準確吸取1 mL 2種標準溶液于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，配制成10 μg/mL的混合標準中間液；準確吸取10 μg/mL的混合標準中間液1 mL，于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，將其變成質量濃度為1 μg/mL的混合標準中間液。

（2）含1%甲酸的乙腈溶液配制。量取10 mL甲酸，加入乙腈稀釋至1 000 mL，混勻。

（3）含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液配制。稱取0.385 4 g乙酸銨，用水溶解并稀釋至1 000 mL，加入1 mL甲酸，混勻。

1.3.2 樣品前處理

（1）提取。準確稱取均質試樣10.0 g（精確到0.1 g）置于50 mL的聚丙烯離心管中，加入20 mL含1%甲酸的乙腈溶液，高速勻漿提取2 min，加入4 g無水硫酸鎂和1 g無水硫酸鈉，立即渦旋混合1 min，以10 000 r/min離心5 min使乙腈和水相分層。

（2）凈化。LC-C18固相萃取柱，使用前用水和甲醇各6 mL活化，精確量取上層乙腈溶液4 mL于LC-C18固相萃取柱中，氮吹管接收凈化液，并抽干萃取柱，于45 ℃氮氣吹干，甲醇定容至1 mL，過0.22 μm有機濾膜上機測定。

1.3.3 標準曲線的繪制

準確稱取空白試樣10.0 g（準確到0.1 g）置于50 mL的聚丙烯離心管中，進行前處理，作為空白基質提取液。分別精確量取混合標準中間液（1 μg/mL）0 μL、10 μL、20 μL 和 40 μL，及標準混合中間液（10 μg/mL）10 μL、15 μL 和 20 μL，用空白基質提取液定容至1.0 mL，作為混合標準工作液，濃度依次為0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL和200 ng/mL，臨用時現配[11]。

1.3.4 儀器條件

色譜條件：C18色譜柱柱溫：30 ℃，流動相：溶劑A（含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液），溶劑B（甲醇）；流速：0.25 mL/min；梯度洗脫條件：0～1 min 5%B，1～ 3 min 5% ～ 95%B，3～ 7.1 min 95%B，7.1～8 min 95%B，8～10 min 5%B。

質譜條件：ESI源，多反應監測（MRM），氬氣為碰撞氣；毛細管溫度（℃）：350，鞘氣（Arb）：45，輔助氣（Arb）：10，噴霧電壓（V）：3 000，離子掃描模式：負離子掃描模式。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

取1 μg/mL的4-CPA和6-BAP混合標準中間液，在液相質譜聯用儀ESI-模式下掃描，優化質譜條件，選擇信號強度理想的母離子和子離子作為定性定量離子，篩選結果見表1。取100 ng/mL的4-CPA和6-BAP混合標準工作液，上機驗證目標物出峰效果，4-CPA和6-BAP的總離子流圖結果見圖1，出峰時間分別為5.78 min和5.66 min，離子豐度比分別為34.1%和49.0%。

圖1 4-CPA和6-BAP的總離子流圖

表1 4-CPA和6-BAP的質譜條件

2.2 標準工作液曲線

4-CPA和6-BAP的系列混合標準工作液均為0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL，40 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL和200 ng/mL，上機檢測，外標法定量。結果數據分析，出現3個母離子，分別是質核比（m/z）為 184.905的 4-CPA、 質 核 比（m/z）為 187.000的4-CPA和質核比（m/z）為224.070的6-BAP，線性回歸方程分別為：Y=729.645+769.358X、Y=3 779.49+2 249.89X和Y=1 991.1+5 621.12X，相關系數R2為0.999 9、0.999 4和0.997 5，呈現線性良好，見圖2。

圖2 4-CPA和6-BAP的線性曲線

2.3 回收率和精密度

豆芽樣品中，加入4-CPA和6-BAP混合標準溶液，選擇在 10 μg/kg，20 μg/kg，100 μg/kg 進行 3 水平回收試驗，每個水平6個平行，回收率和精密度結果如表2所示，平均回收率為84.3%～94.6%，RSD為2.6%～10.3%。

表2 樣品平均回收率和精密度試驗結果

2.4 檢出限和定量限

空白基質中加入4-CPA和6-BAP標準品進行前處理，上機測定，扣除基線后，以信噪比S/N=3時對應的含量為檢出限，信噪比S/N=10時對應的含量為定量限，結果顯示4-CPA的檢出限和定量限分別為 1.54 μg/kg和 4.28 μg/kg，6-BAP 的檢出限和定量限分別為 0.237 μg/kg 和 0.459 μg/kg。

3 結論

本文對豆芽中4-CPA和6-BAP的液相質譜聯用檢測法的前處理過程、液相色譜和質譜條件進行了優化，選擇甲醇活化后的LC-C18固相萃取柱凈化樣品，操作簡單、快速且準確度高。質譜條件優化后，篩選出了4-CPA和6-BAP響應強度較高的離子作為定量定性離子，其離子豐度比為分別為34.1%和49.0%，允許的相對偏差范圍為±25%[12]，可以有效提高檢測的準確性。結果顯示該方法前處理簡單快速、線性良好，回收率和精密度高，可以準確測定豆芽中4-CPA和6-BAP的含量，滿足國內外豆芽中對4-CPA和6-BAP限量的檢測需求。