3D打印海藻酸鈉-明膠皮膚支架及其與成纖維細胞的體外生物相容性研究

余海洋 梅峻豪 秦立昊 劉純 周熠 趙紅斌 李辰凱 賈中芝

慢性創(chuàng)面的修復一直是臨床亟待解決的難題，需要一種經(jīng)濟實惠、有量產(chǎn)前景的人工皮膚[1]。近年來，3D打印技術(shù)逐漸應(yīng)用于人工皮膚支架的制備，而使用該技術(shù)將海藻酸鈉(Sodium alginate，SA)和明膠制成不同規(guī)格的皮膚支架的研究較少[2]。本研究采用RegenHU 3D生物打印機，制備不同規(guī)格的SA-明膠皮膚支架，并對其生物相容性及對大鼠皮膚成纖維細胞生物學行為的影響進行評價，試圖為慢性創(chuàng)面的修復提供一種可降解的3D打印皮膚。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與儀器

大鼠皮膚成纖維細胞(中科院細胞庫)。SA和明膠(麥克林生化科技有限公司)；無血清細胞凍存液(蘇州新賽美生物科技有限公司)；Live/Dead試劑盒(Invitrogen，美國)；羥脯氨酸檢測試劑盒(南京建成生物研究所)；大鼠白介素6酶聯(lián)免疫分析試劑盒(武漢酶免生物科技有限公司)。

1.2 SA-明膠皮膚支架的制備

按照SA的質(zhì)量百分比制成不同規(guī)格的SA-明膠皮膚支架。分別將質(zhì)量百分比為3%、4%、5%的SA粉末與去離子水加入裝有明膠顆粒的燒杯中，40 ℃水浴電磁攪拌2 h，充分混勻后置于37 ℃?zhèn)溆谩Ｊ褂?D打印機配套BioCAD軟件設(shè)計模型：15 mm×15 mm，厚度4層，間距0.8 mm。將SA和明膠原料放入熱熔針筒中，針筒加熱至40 ℃，調(diào)節(jié)溫度為37 ℃恒溫，氣壓0.25 MPa，距離2 mm，打印速度6 mm/s，針頭25 G，分別打印3%、4%、5%的SA-明膠皮膚支架。

1.3 SA-明膠皮膚支架的表征

利用掃描電鏡觀察皮膚支架表面形貌，比較不同規(guī)格的SA-明膠皮膚支架的表面形貌特征。

1.4 大鼠皮膚成纖維(RS1s)細胞的培養(yǎng)

將復蘇后的大鼠RS1s細胞移入25 mL培養(yǎng)瓶中，加入10 mL含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM basic完全培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每隔2 d換液，待細胞貼壁生長至85%時，胰酶消化并傳代。

1.5 生物相容性檢測

將皮膚支架置于12孔板內(nèi)，孔內(nèi)加入2 mL DMEM basic完全培養(yǎng)基，將大鼠RS1s細胞以1×105/孔的密度接種于12孔板內(nèi)，與皮膚支架共培養(yǎng)2 d后，使用Live/Dead染色，倒置熒光顯微鏡下觀察材料表面細胞黏附情況；與材料共培養(yǎng)5 d后，掃描電鏡觀察材料表面細胞的黏附和生長情況。材料置于12孔板內(nèi)，將大鼠RS1s細胞以1×104個/孔的密度接種于12孔板內(nèi)，分別與材料共培養(yǎng)1、3和5 d，加入CCK-8，檢測細胞增殖情況。

1.6 膠原蛋白表達量的檢測

材料置于12孔板內(nèi)，將大鼠RS1s細胞以4×104個/孔的密度接種于12孔板內(nèi)，分別與材料共培養(yǎng)1、2和3 d后，使用羥脯氨酸試劑盒檢測膠原蛋白的含量(膠原蛋白的主要成分為羥脯氨酸)，細胞培養(yǎng)上清經(jīng)過消化液充分消化后，使用酶標儀在550 nm波長下檢測光密度(OD)值。羥脯氨酸含量=(測定管OD-空白管OD)/(標準管OD-測定管OD)×標準品濃度×稀釋倍數(shù)。

1.7 IL-6表達水平檢測

材料置于12孔板內(nèi)，將大鼠RS1s細胞以4×104個/孔的密度接種于12孔板內(nèi)，分別與材料共培養(yǎng)1、2和3 d后，使用大鼠白介素6酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定IL-6表達水平，使用酶標儀在450 nm波長下檢測OD值，根據(jù)標準曲線查出OD值對應(yīng)濃度后乘以稀釋倍數(shù)，最終得到IL-6表達水平。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 皮膚支架的宏觀與微觀結(jié)構(gòu)

肉眼觀：3組皮膚支架呈網(wǎng)格狀，孔徑均勻(圖1)。掃描電鏡：3組皮膚支架均為多孔網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，孔隙均勻；3%SA組皮膚支架的表面較另2組明顯粗糙(圖2)。

圖1 不同規(guī)格SA-明膠皮膚支架的大體觀Fig.1 General view of different SA-Gelatin skin scaffolds

圖2 掃描電鏡下不同規(guī)格SA-明膠皮膚支架的表面形貌(A1-C1：80×；A2-C2：500×)Fig. 2 Surface morphologies of SA-Gelatin skin scaffolds with different specifications under scanning electron microscopy (A1-C1: 80×; A2-C2: 500×)

2.2 皮膚支架的細胞黏附與增殖

Live/Dead染色：細胞與皮膚支架共培養(yǎng)2 d后，在各組皮膚支架表面均能較好地黏附與生長，其中5%SA組細胞數(shù)量少于另2組；掃描電鏡：細胞與皮膚支架共培養(yǎng)5 d時，細胞能在材料表面黏附與生長，其中4%SA組細胞數(shù)量多于另2組(圖3)。

所有的電器元器件都具有適用的期限，如果在超過期限的情況下使用，必然會對工程機械電氣設(shè)備的性能產(chǎn)生不利的影響，這同樣也是不可避免的情況。特別是電機與變壓器使用超過了期限，加之工作環(huán)境條件不理想，導致其絕緣性能受到不利的影響。交流接觸器、繼電器以及電位器在長期使用以后也會出現(xiàn)觸頭電接觸不理想的情況。

A1-C1：掃描電鏡觀察(5 000×)；A2-C2：Live/Dead染色(40×)；A3-C3：Live/Dead染色(100×)；綠色：活細胞；紅色：死細胞。A1-C1: Scanning electron microscope observation (5 000×); A2-C2: Live/Dead staining (40×); A3-C3: Live/Dead staining (100×); Green: living cells; Red: Dead cells.圖3 大鼠皮膚成纖維細胞在3組皮膚支架表面的生長情況Fig.3 Growth of rat epithelial fibroblasts on the surface of skin scaffolds in three groups

CCK-8檢測：如圖4所示，在細胞與皮膚支架共培養(yǎng)1、3和5 d時，4%SA組細胞增殖率顯著高于另2組，且差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，第1天與第5天時3%SA組與5%SA組細胞增殖率無明顯差異(P>0.05)。

圖4 各組細胞與皮膚支架共培養(yǎng)1、3和5 d的增殖情況Fig. 4 Proliferation of cells in each group after co-cultured with skin scaffolds for 1, 3 and 5 days

2.3 皮膚支架對細胞膠原蛋白分泌的影響

圖5顯示，細胞與皮膚支架共培養(yǎng)1、2和3 d時，4%SA組膠原蛋白分泌量顯著高于3%SA與5%SA組(P<0.05)，第1、2和3 d時3%SA組與5%SA組膠原蛋白分泌量無明顯差異(P>0.05)。

圖5 各組細胞與皮膚支架共培養(yǎng)1、2和3 d時的羥脯氨酸分泌水平Fig.5 Hydroxyproline secretion levels of cells in each group after co-cultured with skin scaffolds for 1, 2 and 3 days

2.4 皮膚支架對細胞IL-6分泌的影響

如圖6所示，細胞與皮膚支架共培養(yǎng)1、2和3 d時，4%SA組IL-6表達水平顯著低于3%SA與5%SA組(P<0.05)，第1、2和3 d 時3%SA組與5%SA組IL-6表達水平無明顯差異(P>0.05)。

圖6 各組細胞與皮膚支架共培養(yǎng)1、2和3 d時的IL-6表達水平Fig. 6 IL-6 expression levels of cells in each group after co-cultured with skin scaffolds for 1, 2 and 3 days

3 討論

隨著我國人口老齡化日益嚴重，慢性創(chuàng)面患者逐年增多，如糖尿病足潰瘍患者等，慢性創(chuàng)面的救治已經(jīng)成為臨床上棘手的難題[3-5]。人工皮膚在慢性創(chuàng)面的救治過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[6-8]。隨著3D打印技術(shù)的快速發(fā)展，3D打印人工皮膚支架逐漸走進人們的視野，雖然目前已有3D打印皮膚支架的相關(guān)[9-10]，但對3D打印皮膚支架的研究仍處于起始階段，仍需展開相關(guān)的基礎(chǔ)與臨床研究。

3D打印皮膚支架的關(guān)鍵是生物墨水的選擇，即材料的選擇。目前最常用于人工皮膚支架的生物材料包括海藻酸鹽、明膠、膠原蛋白、殼聚糖等，以上材料各有優(yōu)缺點[2]。本研究采用了SA和明膠，SA是一種天然多糖，具有較高的穩(wěn)定性、溶解性、黏性和安全性等[11]。明膠是一種大分子的親水膠體，具有較高的生物相容性和生物可降解性，在體內(nèi)降解后不產(chǎn)生副產(chǎn)物、無免疫原性，并具有與膠原相同的組分和生物性質(zhì)[12]。本研究初步發(fā)現(xiàn)：SA和明膠能夠制成理想的生物墨水，并具有較好的3D打印性能，打印出的SA-明膠皮膚支架在宏觀和微觀上能夠滿足臨床使用需求。

在外觀形貌方面，本研究按照SA的質(zhì)量百分比制成了不同規(guī)格的SA-明膠皮膚支架，雖然3組皮膚支架在宏觀上差別不大，均呈網(wǎng)格狀，并且孔徑均勻，但在微觀結(jié)構(gòu)上，3組皮膚支架存在較大的差異，尤其是3%SA組的皮膚支架，表面較另2組明顯粗糙，這與SA的質(zhì)量百分比不同直接相關(guān)。

不同的微觀形貌，會對細胞的黏附與生長產(chǎn)生一定的影響。因此，在生物相容性方面，雖然細胞在3組皮膚支架表面均能較好地黏附與生長，但4%SA組較另2組更適宜細胞的生長。另外，我們還發(fā)現(xiàn)3組皮膚支架均對大鼠皮膚成纖維細胞的生物學行為有一定的影響，4%SA組羥脯氨酸分泌量顯著高于另2組，這與前面證實的4%SA組更適宜細胞生長的結(jié)果一致。羥脯氨酸是構(gòu)成結(jié)締組織中膠原纖維的主要成分[13]，可以促進創(chuàng)面的修復。因此，4%SA組皮膚支架具有較高的生物相容性，且有利于創(chuàng)面的修復。

IL-6是活化的T細胞和成纖維細胞產(chǎn)生的淋巴因子，作為促炎細胞因子在體內(nèi)炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用[14]。本研究初步發(fā)現(xiàn)4%SA組皮膚支架的IL-6表達水平顯著低于另外兩組，說明4%SA組皮膚支架在一定程度上抑制了IL-6的表達，從而抑制支架局部的炎癥反應(yīng)程度，最終加快創(chuàng)面的修復。

本研究不足之處：①僅進行了體外試驗研究，未進行體內(nèi)試驗驗證，下一步我們將開展動物實驗來驗證4%SA組皮膚支架對慢性創(chuàng)面愈合的作用；②掃描電鏡下觀察皮膚支架上的細胞數(shù)量明顯減少，這可能與皮膚支架的脫水處理導致細胞脫落有關(guān)；③該皮膚支架的降解時間曲線仍需進一步驗證。

綜上所述，本實驗利用3D擠壓式打印成功構(gòu)建了不同規(guī)格的SA-明膠皮膚支架，并初步證明了4%SA-明膠的皮膚支架具有較好的生物相容性和膠原蛋白分泌效應(yīng)，并有效抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，有望為創(chuàng)面修復提供一種可降解的3D打印皮膚支架。