氧化石墨烯氧化狀態(tài)/橫向尺寸對肝臟細胞死亡機制和炎癥反應的影響

陳 曦， 劉佳尚， 洪 華

（華東理工大學教育部醫(yī)用生物材料工程研究中心，材料科學與工程學院，上海 200237）

石墨烯是一種二維碳納米材料，具有比表面積大、電導率高、光學透明性好、機械強度高等優(yōu)點，在電子和生物醫(yī)學領域具有重要的應用價值[1-2]。然而，石墨烯也具有高度疏水性，以及在水環(huán)境中分散性差等缺點，限制了其在生物醫(yī)學方面的應用潛力[3]。氧化石墨烯(GO)是在強酸性和氧化條件下，通過化學剝落石墨，在基面和邊緣位點產(chǎn)生環(huán)氧、羥基和羧基合成而得[4]，更容易在水中分散[5]。GO 保留了石墨烯的大部分特性，可廣泛應用于生物醫(yī)學領域，如藥物輸送、組織工程、生物傳感和生物成像[6-8]等方面。另外，GO 的其他物理化學特性(如表面功能和橫向尺寸)對其在生物醫(yī)學方面的應用也至關重要[9-10]。

雖然已有關于GO 生物相容性的研究報道，但大多數(shù)報道集中在GO 對脊椎動物的抗菌作用或?qū)Ψ谓M織的毒性上[11]，而沒有考慮GO 可能從肺部易位進入其他組織和器官或通過其他途徑進入體循環(huán)[12-13]。此外，作為藥物載體，GO 主要被單核巨噬細胞系統(tǒng)(MPS)吞噬[14]。肝臟中枯氏（Kupffer）細胞是MPS 的重要組成部分，約占體內(nèi)所有肝臟細胞數(shù)的15%或組織中巨噬細胞數(shù)的80%～90%[15-16]。枯氏細胞具有保護肝細胞（Hepatocyte）的功能，包括通過吞噬作用清除細胞碎片或顆粒物質(zhì)[17]。枯氏細胞釋放的降解產(chǎn)物通過肝細胞攝取、代謝和排泄，但該過程可導致炎癥反應，如分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6 (IL-6)和白細胞介素-1β (IL-1β)等炎癥因子[18-19]。此外，枯氏細胞還可調(diào)節(jié)和維持肝細胞的解毒功能，如通過細胞色素P450 酶的代謝轉(zhuǎn)化化學物質(zhì)[20-21]。由此可見，枯氏細胞與肝細胞之間存在大量的胞間交流。肝竇內(nèi)皮細胞(Liver Sinusoidal Endothelial Cell,LSEC)作為重要的過濾屏障也參與胞間交流，并調(diào)控枯氏細胞與肝細胞之間的抗炎反應環(huán)路[22]，這包括分泌干擾素-β (IFN-β)和白細胞介素-10（IL-10）[23-24]。大量研究證明，顆粒物質(zhì)(包括納米材料)能破壞枯氏細胞、肝細胞和肝竇內(nèi)皮細胞之間的穩(wěn)態(tài)關系，同時會對肝臟組織產(chǎn)生不良后果。特別是GO 可以進入血液并影響肝臟功能，包括產(chǎn)生急性和慢性炎癥反應[25-27]。然而，GO 與不同肝臟細胞的相互作用機制尚未完全揭示。

雖然曾有科學家試圖將GO 的物理化學性質(zhì)(如橫向尺寸和氧化狀態(tài))與細胞毒性聯(lián)系起來，但這些結(jié)果彼此矛盾[28-31]。例如，Zhang 等[30]報道，在HeLa 細胞中，尺寸較小的GO 比尺寸較大的GO 能誘導更高的氧化應激反應和細胞毒性。相反，Ma 等[31]發(fā)現(xiàn)，在J774A1 細胞中，尺寸較大的GO 比尺寸較小的GO 更容易誘導細胞毒性和炎癥反應。除了GO 的大小，鮮有報告詳細說明其他理化性質(zhì)對GO 生物安全性的影響[32-33]。Li 等[34-35]最近證明了GO 表面的氧化和水合狀態(tài)在催化抗菌反應和誘導哺乳動物細胞毒性方面的重要性，并證明了水合GO 表現(xiàn)出極高的碳自由基密度，它們通過膜結(jié)合和誘導脂質(zhì)過氧化反應，分別對大腸桿菌和哺乳動物細胞產(chǎn)生抑菌作用和毒性作用。然而，類似的表面功能對肝臟細胞(如枯氏細胞、肝竇內(nèi)皮細胞和肝細胞)的影響鮮見被探索。

本文研究不同氧化狀態(tài)和橫向尺寸的GO 對3 種肝臟細胞枯氏細胞Kup5、肝竇內(nèi)皮細胞SKHEP-1 和肝細胞Hepa 1-6 生物學功能的影響。首先制備了大小兩種不同尺寸(分別約為510 nm 和110 nm)的原始氧化態(tài)氧化石墨烯(pGO)和還原態(tài)氧化石墨烯(rGO)的薄片（根據(jù)尺寸不同分別表示為pGO-L，pGO-S 和rGO-L，rGO-S）。其次，系統(tǒng)研究了不同GO 對細胞毒性、細胞攝取、細胞膜黏附、溶酶體損傷、細胞死亡和炎癥反應的影響。實驗結(jié)果表明GO 在肝臟細胞系中產(chǎn)生了不同的細胞死亡機制和炎癥反應，這與GO 的氧化狀態(tài)和橫向尺寸密切相關。實驗結(jié)果為后續(xù)構(gòu)效關系(Structure-activity relationships)的建立提供了重要的實驗數(shù)據(jù)支持，也為評估GO 材料的安全性提供了理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 pGO 和rGO 的合成

通過Hummers 方法制備pGO。簡單來說，首先將石墨薄片（AsburyMills3061 級）氧化，過濾并離心以除去殘留的污染物；然后將氧化的石墨薄片重新分散在N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）中，并在冰浴中用55W 超聲波分解器超聲處理2 h；最后以5000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min 收集樣品，并用去離子水洗滌3 次，得到pGO。

rGO 的合成。將pGO 分散在NMP 中，在55 W超聲波分解器中超聲處理1 h，然后在150 ℃硅油浴中攪拌5 h，用去離子水洗滌3 次以除去殘留的NMP，得到rGO。

1.2 pGO 和rGO 的熒光標記

通過酰胺化反應制備牛血清蛋白-異硫氰酸熒光素（BSA-FITC）熒光標記的pGO 和rGO 樣品。將5 mg 1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和10 mg N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）分別溶解在2 mL 的pGO 和rGO 的懸浮液（pGO 和rGO 的質(zhì)量濃度均為100 μg/mL）中。然后將上述溶液在室溫下攪拌2 h，再將pGO 和rGO 沉淀物用去離子水洗滌2 次，并通過15000 r/min 離心10 min 進行收集。將收集的pGO 與rGO 樣品分別與1 mL BSAFITC 溶液（0.1 mg/mL）混合攪拌并反應12 h。隨后，將樣品在去離子水中洗滌3 次，得到熒光標記的pGO 和rGO 樣品。

1.3 pGO 和rGO 的理化特性表征

（1）采用原子力顯微鏡（AFM，牛津儀器科技（上海）有限公司, Cypher ES 型）確定pGO 和rGO 樣品的薄片尺寸。將pGO 或rGO 薄片沉積在經(jīng)（3-氨基丙基）-三乙氧基硅烷（APTES，2.5 mmol/L）水溶液預處理的硅片上，然后在250 °C 退火30 min。在每個樣品的隨機位置捕獲AFM 圖像，并使用Gwyddion成像處理軟件對圖像進行后處理。通過分析至少25 個單獨的薄片以獲得所有薄片樣品的平均大小。

（2）pGO 和rGO 的元素組成和化學狀態(tài)測定。采用帶有光斑大小為300 μm 的單色AlKα源和電荷補償溢流槍的X 射線光電子能譜儀（XPS，Thermo Scientific ESCALAB 250Xi）進行評估。

（3）采用拉曼光譜儀（Renishaw plc, 英國Renishaw公司），對pGO 和rGO 樣品的化學結(jié)構(gòu)進行表征。

（4）采用Zeta 電位分析儀（美國Brookhaven 儀器公司, NanoBrook ZetaPALS 型）測量pGO 和rGO 樣品的動態(tài)尺寸和ζ電位。

（5）采用接觸角測量儀（FTA125 型，美國 First Ten Angstrams 公司）測量pGO 和rGO 的接觸角。

1.4 吞噬溶酶體模擬液（PSF）的配制

分別將4084.6 mg 鄰苯二甲酸氫鉀、142.0 mg無水磷酸氫二鈉、6650.0 mg 氯化鈉、71.0 mg 無水硫酸鈉、29.0 mg 氯化鈣二水合物和450.0 mg 甘氨酸加入到1 L 去離子水中，混合均勻，并用0.1 mol/L 氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)至pH=4.5。

1.5 肝臟細胞培養(yǎng)

將Kup5 在37 °C 和5%（體積分數(shù)，下同）CO2環(huán)境中培養(yǎng)于Dulbecco's Modified Eagle's 培養(yǎng)基（DMEM）中，該培養(yǎng)基含有10%（體積分數(shù)，下同）胎牛血清，10 μg/mL 牛胰島素，100 units /mL 青霉素，100 g/mL 鏈霉素和250 μmol/L 1-硫代甘油細胞通過TrypLETMExpress 消化后用于傳代培養(yǎng)。將SKHEP-1 在37 °C 和5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)于Eagle's Minimum Essential 培養(yǎng)基（EMEM，包含10%胎牛血清，100 units /mL 青霉素和100 g/mL 鏈霉素）中，并通過2.5 mg/mL 胰蛋白酶（溶于磷酸鹽緩沖液中）?0.53 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）消化后用于傳代培養(yǎng)。將Hepa 1-6 在37 °C 和5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)于DMEM 中，并通過2.5 mg/mL 胰蛋白酶（溶于磷酸鹽緩沖液中）?0.53 mmol/L EDTA 消化后用于傳代培養(yǎng)。

1.6 細胞毒性評估

將Kup5、SK-HEP-1 和Hepa 1-6 各2×104個細胞分別接種到黑底色的96 孔板（細胞死亡實驗）中或白底色的96 孔板（細胞活力測定）中過夜。將除Hepa 1-6 外的細胞用0.5 μg/mL 脂多糖（LPS）預處理4 h，然后再將細胞暴露于質(zhì)量濃度分別為6.25、12.5、25 μg/mL 和50 μg/mL 的pGO 或rGO 材料中24 h。通過CellToxTMGreen 細胞毒性檢測試劑盒分析細胞死亡情況，通過ATPliteTM一步法檢測系統(tǒng)分析細胞活力[36]。在SpectraMax M5 微孔板分光光度計上讀取熒光（細胞死亡測定）和發(fā)光強度（細胞活力測定）。

1.7 膜聯(lián)蛋白V /碘化丙腚染色評估細胞死亡

將Kup5、SK-HEP-1 和Hepa1-6 各1×106個細胞分別接種于孔板中，并用pGO 或rGO（50 μg/mL），在5% CO2環(huán)境中于37 °C 孵育16 h。用細胞鏟（Fisher Scientific）鏟取細胞，然后通過200g離心5 min 收集。然后將細胞懸浮在含有50 μg/mL 膜聯(lián)蛋白V 和50 μg/mL 碘化丙錠（PI）的結(jié)合緩沖液中進行染色。避光、冰浴孵育15 min 后，通過流式細胞儀分析細胞。在FITC 通道中測量膜聯(lián)蛋白V 熒光，在藻紅蛋白（PE）通道中測量PI 熒光。使用前向散射（FSC）和側(cè)向散射（SSC）獲取至少10 000 個細胞的數(shù)據(jù)。將凋亡細胞鑒定為膜聯(lián)蛋白V 或膜聯(lián)蛋白V/PI 陽性細胞，而非凋亡細胞鑒定為膜聯(lián)蛋白V 陰性/PI 陽性細胞。

1.8 細胞凋亡評估

將Kup5、SK-HEP-1 各2×104個細胞分別接種在96 孔板（白底色）的每個孔中，并放置過夜。在暴露于50 μg/mL 的pGO 或rGO 之前，先用0.5 μg/mL LPS 對細胞進行預處理。孵育16 h 后，通過使用Caspase-GLO3/7 發(fā)光測定試劑盒（Promega）檢測caspase-3/caspase-7 表達來評估細胞凋亡。

1.9 細胞骨架解離評估

將Kup5 細胞以每孔5×104個的細胞密度接種到8 孔的帶蓋玻片上。然后在37 °C、5% CO2環(huán)境下與50 μg/mL pGO 共孵育。12 h 后，將細胞用4%（質(zhì)量分數(shù)，下同）多聚甲醛（ PFA）固定20 min。將細胞骨架和細胞膜分別用5 μg/mL AF647-phalloidin 和5 μg/mL AF488-偶聯(lián)小麥胚芽凝集素（WGA）染色30 min，使用共焦顯微鏡觀察細胞骨架。

1.10 材料與細胞結(jié)合評估

將Kup5、SK-HEP-1、Hepa 1-6 各4×104個細胞接種到8 孔板中，孵育過夜，然后在37 °C 下與50 μg/mL的pGO 或rGO 共培養(yǎng)16 h。處理后，將細胞用PBS洗滌3 次，然后用4% PFA 固定30 min。細胞膜和細胞核分別用AF488-WGA（5 μg/mL）和Hoechst 33342（10 μg/mL）染色30 min。使用共聚焦顯微鏡觀察pGO 或rGO 與細胞的結(jié)合情況。使用細胞鏟鏟取細胞，在低溫PBS 中洗滌3 次。通過流式細胞儀對至少104個細胞進行側(cè)向散射分析來評估材料與細胞的結(jié)合百分比。為了抑制B 族I 型清道夫受體（SRB1），使用選擇性抑制劑BLT-1（Block Lipid Transport-1，Sigma）對SK-HEP-1 和Hepa1-6 細胞進行8 h 預處理，再通過流式細胞儀的側(cè)向散射對細胞攝取進行定量，并且每種樣品至少分析104個細胞。

1.11 材料與細胞膜相互作用評估

將Kup5、SK-HEP-1 和Hepa 1-6 各5×105個細胞接種在12 孔板上，過夜后暴露于50 μg/mL pGO 或rGO 中。6 h 后，將細胞用2%（質(zhì)量分數(shù)）戊二醛固定2 h，再在1%（質(zhì)量分數(shù)）四氧化鋨（OsO4）中固定1 h，將細胞在用環(huán)氧丙烷處理的分級乙醇梯度（體積分數(shù)分別為30%，50%，70%，90%和100%）中脫水，并嵌入樹脂中。在超薄切片機上切割成厚度約為50～70 nm 的切片。切片用醋酸鈾酰和Reynolds 檸檬酸鉛染色，并在透射電子顯微鏡（TEM）下進行觀察。

1.12 細胞膜脂質(zhì)過氧化評估

將Kup5、SK-HEP-1、Hepa 1-6 各4×104個細胞接種到8 孔板中，孵育過夜，然后再暴露于25 μg/mL pGO 或rGO 中12 h。 將20 μmol/L 過氧化氫異丙苯（CH）處理1.5 h 的細胞用作陽性對照。 處理后，將細胞用PBS 洗滌3 次，然后用10 μmol/L 脂質(zhì)過氧化探針I(yè)mage-iT 染色30 min。分別在581 nm/591 nm（Texas Red）和488 nm/510 nm（FITC）的激發(fā)/發(fā)射波長下檢測到成像探針的還原和氧化。通過使用流式細胞儀中的FITC 通道定量細胞脂質(zhì)過氧化的百分比。

1.13 溶酶體損傷和組織蛋白酶B 釋放評估

將Kup5、SK-HEP-1 和Hepa 1-6 各4×104個細胞接種到8 孔板中，并放置過夜。將細胞（Hepa 1-6 除外）用0.5 μg/mL LPS 預處理4 h，然后，將200 μL pGO 或rGO 以50 μg/mL 的劑量添加到細胞中，并孵育6 h。再用4%PFA 固定30 min，將細胞用PBS 洗滌3 次，并以26 nmol/L 的Magic Red（ImmunoChemistry Technologies）染色2 h。以未暴露的細胞用作陰性對照，以50 μg/ mL 尿酸單鈉（MSU）處理的細胞用作陽性對照。

1.14 白細胞介素-1β（IL-1β）分泌評估

將Kup5、SK-HEP-1 和Hepa 1-6 各2×104個細胞接種到96 孔板中，并放置過夜。用0.5 μg/mL LPS 預處理細胞（Hepa 1-6 除外）后，分別用質(zhì)量濃度為 6.25、 12.5、 25 μg/mL 和 50 μg/mL 的 pGO 和rGO 處理細胞。24 h 后收集上清液，評估IL-1β 濃度。

2 實驗結(jié)果

2.1 GO 納米片的制備及理化性質(zhì)表征

參照文獻[35]方法制備氧化狀態(tài)和橫向尺寸不同的GO 納米片。通過原子力顯微鏡研究GO 納米片的橫向尺寸和形貌，顯示pGO-S 和rGO-S 的橫向尺寸分別約為115、161 nm，pGO-L 和rGO-L 的橫向尺寸分別約為510、501 nm (圖1（a） )。利用X 射線光電子能譜測定GO 的表面官能團，在284、286、288、290 eV 處得到特征峰，分別代表C?C、C?O、C＝O 和O＝C?O 基團(圖1（b）)。通過分析官能團分布，證明rGO 中氧質(zhì)量分數(shù)比pGO 中顯著降低(表1)。利用拉曼光譜對材料的結(jié)構(gòu)進行評估，特征D 峰(峰值約為1331 cm?1)表示sp2碳環(huán)的無序，G 峰(峰值約為1596 cm?1)表示C?C 鍵的拉伸，評估結(jié)果符合納米片石墨烯的特征(圖1（c）)。通過確定D 峰峰強(ID)和G 峰峰強(IG)的比值，對結(jié)構(gòu)缺陷進行評估，顯示rGO 樣品中結(jié)構(gòu)缺陷略有增加，這很可能是還原過程導致的結(jié)果[37]。此外，還原過程可改變GO 的疏水性/親水性，因此，進一步測量了GO 樣品的接觸角，如圖1（d）所示。與原始樣品pGO-L 的接觸角（60.3°±1.2°）相比，rGO-L 的接觸角增加到93.4°±1.5°，表明rGO-L 的表面疏水性增加。

表1 GO 材料的氧碳質(zhì)量比和氧化基團質(zhì)量分數(shù)Table 1 Quantification of oxygen-to-carbon mass ratio and the mass fractions of oxidized groups of GO materials

圖1 GO 材料理化性質(zhì)的表征Fig. 1 Physicochemical characterizations of GO materials

將GO 分別懸浮在Kup5、SK-HEP-1 和Hepa 1-6 細胞培養(yǎng)液中測定pGO 和rGO 的大小分布 (表2)。在3 種細胞培養(yǎng)液中，pGO-S 和rGO-S 的大小約為260～390 nm，而pGO-L 和rGO-L 的大小約為450～770 nm。聚合物分散性指數(shù)（PDI）均小于0.4，說明pGO 和rGO 在這些介質(zhì)中分布較好。此外，所有樣品在細胞培養(yǎng)基中顯示負電位。綜上所述，證實已經(jīng)制備出后續(xù)實驗所需的GO，用于研究其氧化狀態(tài)和橫向尺寸對肝臟各類細胞的影響和作用。

表2 pGO 和rGO 納米片在細胞培養(yǎng)基中的水合粒徑和Zeta 電位Table 2 Hydrodynamic size and Zeta potential of pGO and rGO nanosheets in different cell culture media

2.2 GO 在肝臟細胞中的細胞毒性效應

以氧化鋅納米顆粒(ZnO,D=（22.6 ± 5.1）nm)作為陽性對照，誘導細胞毒性，如圖2 所示。可見3 種肝臟細胞孵育24 h 后，pGO 和rGO 的細胞毒性存在顯著差異。隨著劑量(0 ～ 50 μg/mL)的升高， pGO 和rGO 誘導的Kup5 細胞死亡增加（圖2（a）），同時伴隨著細胞活力下降(圖2（b）)。在Kup5 細胞中，pGO 的毒性高于rGO，而pGO-L 和rGO-L 的毒性高于pGOS 和rGO-S。與Kup5 相比，pGO 對SK-HEP-1 的細胞毒性未被檢測到，但rGO 呈現(xiàn)顯著毒性。當劑量達到50 μg/mL 時，SK-HEP-1 細胞在rGO-S 和rGO-L中的死亡率分別為72.6%和69.4%。值得注意的是，在所有劑量的實驗中，無論GO 橫向尺寸的大小如何，Hepa 1-6 細胞對pGO 或rGO 的反應均顯示出最小的細胞死亡率。以熱區(qū)圖形式表達的細胞死亡(圖2（c）)清楚地顯示了pGO 和rGO 在肝臟細胞中不同的細胞毒性。

圖2 GO 在 Kup5、 SK-HEP-1 和 Hepa 1-6 細胞中的毒性實驗Fig. 2 Cytotoxicity of GO in Kup5, SK-HEP-1 and Hepa 1-6 cells

2.3 GO 誘導三種肝臟細胞死亡的機制

進一步研究GO 誘導細胞死亡的機制。采用流式細胞儀分析細胞凋亡情況，并使用膜聯(lián)蛋白V 染色，以ZnO 納米顆粒作為陽性對照。結(jié)果顯示，膜聯(lián)蛋白V 沒有顯著變化，表明Kup5 屬于非凋亡性細胞死亡。觀察圖3（a）可知，rGO 誘導Kup5 細胞凋亡[38]，rGO-L 和rGO-S 分別導致44.0%和45.0%的細胞凋亡；相比之下，經(jīng)pGO-S 或pGO-L 處理后的SK-HEP-1 很少有凋亡或非凋亡性細胞死亡，然而，rGO 卻誘導SK-HEP-1 細胞凋亡； 在經(jīng)pGO 或rGO 處理后的Hepa 1-6 細胞中，未觀察到明顯的凋亡或非凋亡性細胞死亡。為了進一步證實Kup5 和SK-HEP-1 的細胞凋亡情況，檢測了caspase -3 和caspase-7 的活化程度（ 圖3（ b） ） 。 結(jié)果表明caspases-3 和caspase-7 在Kup5 和SK-HEP-1 細胞中被rGO激活。Kup5 細胞中，caspases-3 和caspase-7 的活性在rGO-L 組和rGO-S 組中分別增長了3.9 倍和3.3 倍；而SK-HEP-1 細胞中caspases-3 和caspase-7 的活性在rGO-L 組和rGO-S 組中則分別增長了1.6 倍和1.8 倍。與控制組相比，pGO 處理的Kup5和SK-HEP-1 細胞中均未檢測到明顯的caspase-3 和caspase-7。綜上所述，pGO 在Kup5 細胞中觸發(fā)非凋亡性細胞死亡，但對SK-HEP-1 細胞幾乎無影響；而rGO 在Kup5 和SK-HEP-1 細胞中均主要觸發(fā)凋亡性細胞死亡；所有GO 對Hepa 1-6 細胞均未檢測到明顯的細胞毒性。圖3（c）所示的差異干涉對比(DIC)顯微鏡檢測結(jié)果進一步表明，pGO 誘發(fā)Kup5細胞腫脹，但不誘發(fā)SK-HEP-1 或Hepa 1-6 細胞腫脹。特別是pGO 引起Kup5 細胞腫脹后細胞膜破裂，導致細胞內(nèi)部物質(zhì)大量釋放，這些圖像使人聯(lián)想到細胞程序性壞死（necroptosis）的特征，即細胞骨架結(jié)構(gòu)遭受破壞并發(fā)生細胞質(zhì)和細胞膜脫離。為了研究pGO 處理后細胞骨架從細胞膜上的脫離情況，用Alexa Fluor 633（AF663）偶聯(lián)鬼筆環(huán)肽（phalloidin）染色Kup5 細胞骨架(F-actin)，用WGA 488 染色細胞膜，發(fā)現(xiàn) pGO 劑量為50 μg/mL 時，大量細胞骨架從細胞膜上脫落(圖3（d）)。

圖3 GO 誘導3 種肝臟細胞死亡的機制Fig. 3 Mechanisms of cell death for three types of liver cells induced by GO

2.4 GO 與肝臟細胞結(jié)合并引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應

細胞死亡機制差異可能是由于pGO 和rGO 與細胞膜、細胞器等相互作用的差異而產(chǎn)生的。將熒光標記的納米片在Kup5 細胞中暴露16 h。細胞膜用Alexa Fluor 594 (WGA 594)共染色，細胞核用Hoechst 33342 染色。GO 與肝臟細胞結(jié)合實驗如圖4 所示。由圖4（a）可知，與原始材料相比，雖然pGO （pGOL 和pGO-S）可以與Kup5 細胞相互作用，但表面膜的廣泛損傷和脫落（白色箭頭所示）干擾了顆粒的觀察或細胞的攝取。rGO（ rGO-L 和rGO-S）在Kup5 細胞中表現(xiàn)出廣泛的細胞攝取能力，細胞膜損傷可忽略不計。流式細胞儀的側(cè)向散射粒度分析結(jié)果證實了pGO 和rGO 細胞關聯(lián)的總體差異。這一結(jié)果與TEM 圖像一致，rGO 納米片被帶入Kup5 細胞，而pGO 黏附在Kup5 膜上，可導致膜過氧化，從而導致膜損傷(圖4（d）)。與Kup5 細胞相比，未發(fā)現(xiàn)pGO和rGO 造成SK-HEP-1 細胞膜損傷(圖4（b）)。流式細胞儀分析結(jié)果證實pGO 和rGO 與SK-HEP-1細胞結(jié)合比例相接近(25.6%～34.6%)，而pGO 和rGO 與Hepa 1-6 細胞結(jié)合較少(<12%，圖4（c）)，值得注意的是pGO 和rGO 與SK-HEP-1 細胞的結(jié)合比例高于其與Hepa 1-6 細胞的結(jié)合比例；前期研究發(fā)現(xiàn)肝竇內(nèi)皮細胞表達了大量的SR-B1，該受體介導脂質(zhì)轉(zhuǎn)移和細胞攝取，而肝細胞中SR-B1 的表達相對較低[39]，因此推測SK-HEP-1 和Hepa 1-6 細胞結(jié)合程度差異可能是由SR-B1 介導所致。為證明該觀點，在用pGO 和rGO 處理SK-HEP-1 細胞和Hepa 1-6 細胞之前，使用選擇性抑制劑BLT-1 來阻斷SR-B1 信號。為便于對比，分別用藍色和紅色表示SR-B1 信號被阻斷前后的細胞結(jié)合情況，如圖4（e）所示。結(jié)果表明，SR-B1 信號被阻斷后，GO 與SK-HEP-1 細胞的結(jié)合比例顯著降低至5%以下，相比較而言，GO 與Hepa 1-6 細胞結(jié)合情況未見明顯差異。這表明SR-B1在pGO 或rGO 對SK-HEP-1 的細胞攝取中起著重要作用，也解釋了GO 對SK-HEP-1 和Hepa 1-6 在細胞結(jié)合和細胞攝取方面存在差異的原因。

圖4 GO 與肝臟細胞的細胞結(jié)合實驗Fig. 4 Cellular association of GO with liver cells

Li 等[35]已證明pGO 可以誘導細胞膜上的脂質(zhì)過氧化。因此，以氫過氧化異丙苯(CH)作為陽性對照，使用C11-BODIPY 試劑（Image-iT kit）檢測三種肝臟細胞被pGO 和rGO 處理后細胞膜脂質(zhì)過氧化情況（圖5）。在過氧化過程中，C11-BODIPY 試劑(激發(fā)和發(fā)射波長分別為581 nm 和591 nm)的熒光發(fā)射峰從約590 nm(紅色)處轉(zhuǎn)移到約510 nm(綠色)處，表明pGO 在Kup5 細胞中誘導了細胞膜脂質(zhì)過氧化，而在SK-HEP-1 和Hepa 1-6 細胞中，pGO 未造成明顯的細胞膜脂質(zhì)過氧化。流式細胞儀結(jié)果顯示pGO-S 和pGO-L 分別誘導8.1%和16.9%的Kup5 細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化(圖5（a）)。相比之下，SK-HEP-1和Hepa 1-6 細胞未見明顯脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象(圖5（b）～5（c）)。而rGO 對Kup5、SK-HEP-1 和Hepa 1-6 細胞的脂質(zhì)過氧化作用均較小。綜上所述，pGO 誘導Kup5 細胞膜脂質(zhì)過氧化可能是導致Kup5 表面膜損傷和細胞死亡的原因。

圖5 GO 誘導肝臟細胞脂質(zhì)過氧化實驗Fig. 5 Lipid peroxidation test of liver cells induced by GO

2.5 GO 引發(fā)肝臟細胞溶酶體損傷和炎癥反應

除了與細胞膜間的相互作用，GO 也會被細胞內(nèi)吞。Wang 等[38]已經(jīng)證明了氧化石墨烯基材料可以誘導巨噬細胞內(nèi)的溶酶體損傷，導致組織蛋白酶B（Cathepsin B）外釋，進而激活NLRP3 炎癥小體及促使IL-1β 的釋放[40]。使用組織蛋白酶B 底物Magic Red （26 nmol/L）檢測Kup5 細胞中溶酶體損傷及組織蛋白酶B 外釋情況(圖6)。用尿酸單鈉(MSU)晶體作為陽性對照，從點狀染色模式變?yōu)槿苊阁w損傷后的彌漫性染色模式。結(jié)果表明，pGO 未造成Kup5細胞溶酶體損傷，這與2.4 節(jié)實驗結(jié)果相符合。在Kup5 細胞中，pGO 主要與細胞膜相互作用，未被Kup5 細胞內(nèi)吞(圖4（d）)，而rGO 導致顯著的溶酶體損傷。pGO 和rGO 均被肝竇內(nèi)皮細胞內(nèi)吞，但只有rGO 引起溶酶體損傷。在pH 為4.5 的溶酶體模擬液(PSF)中觀察pGO 和rGO 的行為[41]，結(jié)果顯示，rGO 在PSF 模擬液中尺寸顯著增加，達到幾微米以上，而pGO 的尺寸增加較少（約1 μm），表明pGO相對于rGO 在PSF 模擬液中較為穩(wěn)定(表3)。這一結(jié)果與圖3（c）中rGO 在細胞內(nèi)大量聚集現(xiàn)象相一致。溶酶體的平均大小為0.1 ～ 1.2 μm，因此認為rGO 在溶酶體中的不穩(wěn)定性導致了溶酶體損傷[42]。

表3 pGO 和rGO 在溶酶體模擬液（pH 4.5）中6 h 后的水合粒徑Table 3 Hydrodynamic sizes of pGO and rGO after suspending in lysosomal simulant fluid (pH 4.5) for 6 h, respectively

進一步評估了三種肝臟細胞暴露于不同質(zhì)量濃度pGO 和rGO 中24 h 后IL-1β 的釋放情況，如圖7所示。可以看出rGO 誘導Kup5 和SK-HEP-1 細胞中IL-1β 的釋放，而pGO 對兩者的影響可忽略。其中，rGO-L 和rGO-S 因尺寸不同造成Kup5 細胞中IL-1β 的釋放量不同，相比而言這種現(xiàn)象在SK-HEP-1 中并不明顯。這與細胞毒性結(jié)果一致。同時檢測了Hepa-1-6 細胞中IL-1β 的釋放情況，表明pGO 和rGO 對IL-1β 釋放造成的影響差別很小(圖7（c）)。

圖7 Kup5，SK-HEP-1 和 Hepa 1-6 三種肝臟細胞暴露于pGO 和rGO 24 h 后 IL-1β 的釋放Fig. 7 IL-1β production induced by pGO and rGO in Kup5, SKHEP-1, and Hepa 1-6 after 24 h incubation, respectively

3 討 論

研究了不同氧化狀態(tài)和橫向尺寸的GO 材料在三種肝臟細胞(枯氏細胞、肝竇內(nèi)皮細胞和肝細胞)中的細胞毒性和炎癥反應。結(jié)果表明在三種類型肝臟細胞中，GO 在細胞毒性和促炎癥作用方面存在顯著差異。這些毒理學效應差異是GO 與細胞膜、細胞內(nèi)吞、細胞溶酶體等作用機制不同所導致的結(jié)果。重要的是，細胞毒性效應和炎癥反應取決于GO 的表面氧化狀態(tài)和橫向尺寸。GO 誘導肝臟細胞死亡和促炎癥反應機理如圖8 所示。本文的主要發(fā)現(xiàn)為：

圖8 GO 誘導Kup5，SK-HEP-1 和 Hepa 1-6 三種肝臟細胞死亡和促炎癥反應機理示意圖Fig. 8 Schematic illustration of GO induced differential cell death mechanisms and pro-inflammatory responses in Kup5, SK-HEP-1, and Hepa 1-6 cells

（1）在三種肝臟細胞類型中，GO 在細胞毒性方面表現(xiàn)出明顯差異，這取決于細胞表面氧化狀態(tài)和橫向尺寸。pGO 僅對Kup5 有誘導壞死作用（pGO-L>pGO-S），對SK-HEP-1 和Hepa 1-6 無毒性作用。rGO 對三種肝臟細胞顯示出不同的細胞毒性和細胞死亡機制。rGO 對Kup5 和SK-HEP-1 均有誘導凋亡作用，但對Hepa 1-6 的毒性較小。pGO 和rGO 造成的細胞死亡機制差異與細胞相互作用相關。透射電鏡顯示，pGO-L 通過其平坦的一側(cè)附著在Kup5 細胞膜上，而沒有被細胞吞噬（圖4（d））。這可能是因為首先pGO 表面上存在含氧親水基團(如羥基、羧基、環(huán)氧基)，使pGO 具有兩親性，且pGO-L 的接觸角為60.3°±1.2° (圖1（e）)。其次在含血清的細胞培養(yǎng)基中，pGO 相對分散，其尺寸小于0.5 μm，因而其相對較小的尺寸及帶負電荷的表面基團削弱了其與帶負電荷的細胞膜之間的相互作用，所以未被細胞吞噬[43-44]。此外，pGO 表面具有活性高的碳自由基，可以與細胞膜發(fā)生反應，引起脂質(zhì)過氧化，進而導致細胞膜損傷和細胞死亡[35]。在Kup5 細胞中，pGO-L 和rGOL 比pGO-S 和rGO-S 的毒性更大。rGO 未造成Kup5 細胞膜脂質(zhì)過氧化(圖5)，但是rGO 被Kup5 細胞和SK-HEP-1 細胞內(nèi)吞，主要是因為rGO 尺寸較大，更容易觸發(fā)吞噬作用[44]。同時，rGO 的細胞膜富含烷基脂類和膽固醇，使細胞表面具有疏水特性，有助于疏水材料的內(nèi)吞[45-46]。rGO 在溶酶體環(huán)境中不穩(wěn)定，形成團聚體(>10 μm)，從而引起溶酶體損傷（圖6），通過Fenton 反應釋放Fe2+，生成活性氧，釋放組織蛋白酶B、D、L，導致線粒體功能障礙和細胞凋亡[47]。此外，組織蛋白酶B 的釋放觸發(fā)NLRP3 炎癥小體的激活，導致IL-1β 的釋放，并引起細胞凋亡。同樣，在肝竇內(nèi)皮細胞中，rGO 也被SK-HEP-1 細胞內(nèi)吞，導致細胞凋亡和IL-1β 的產(chǎn)生，其機制可能與Kup5 相似，但不同橫向尺寸之間沒有差異。對Hepa 1-6 細胞而言，由于rGO 和pGO 與細胞膜相互作用和細胞攝取程度較低，所以pGO 和rGO 均未引起毒性。

圖6 Kup5 細胞在pGO 和rGO（50 μg/mL）中處理6 h 后溶酶體損傷及組織蛋白酶B 釋放Fig. 6 Lysosomal damage and cathepsin B release in Kup5 cells after treated by pGO and rGO (50 μg/mL) for 6 h,respectively

（2）Kup5，SK-HEP-1 和Hepa 1-6 三種肝臟細胞暴露于GO 后，在IL-1β 的產(chǎn)生方面顯示出顯著炎癥反應差異。對于Kup5 細胞，rGO 通過細胞吞噬進入細胞，并遷移至溶酶體，進而誘導溶酶體損傷。溶酶體損傷誘發(fā)組織蛋白酶B 釋放和NLRP3 炎癥小體激活，從而觸發(fā)IL-1β 分泌[48]。此外，與較小尺寸的rGO 相比，較大尺寸的rGO 誘導更高的IL-1β 分泌量，因為它們形成較大團聚體，導致更大范圍溶酶體損傷(圖7)。相比之下，pGO 主要與Kup5 細胞膜相互作用未被內(nèi)吞，從而未有溶酶體損傷，也幾乎未引起IL-1β 分泌。對于SK-HEP-1 細胞，pGO 和rGO 被細胞內(nèi)吞程度接近。但只有rGO 觸發(fā)NLRP3炎癥小體激活和IL-1β 分泌。這可能由于rGO 在溶酶體內(nèi)大量聚集而導致溶酶體損傷。在Hepa 1-6 細胞中，pGO 和rGO 幾乎未誘導細胞產(chǎn)生IL-1β，這是因為pGO 和rGO 與Hepa 1-6 細胞膜相互作用較少，且被細胞內(nèi)吞程度較小。

GO 廣泛應用于生物醫(yī)學領域，包括藥物輸送、組織工程、生物傳感和生物成像。肝臟是GO 的一個主要靶點，不同類型的肝臟細胞對GO 的細胞毒性和炎癥作用呈現(xiàn)差異化，主要是因為GO 表面氧化狀態(tài)和橫向尺寸不同所致。這些實驗數(shù)據(jù)有助于設計更安全的生物醫(yī)用GO。例如，與大尺寸的pGO 相比，小尺寸的pGO 對枯氏細胞、肝竇內(nèi)皮細胞和肝細胞的細胞毒性和炎癥作用更低。進一步對GO 進行表面修飾，如聚乙二醇化或涂覆多聚物，可能需要減少GO 與枯氏細胞膜的相互作用，從而減少脂質(zhì)過氧化、細胞膜損傷和細胞死亡。此外，應該避免使用rGO，因為rGO 在細胞中形成聚集，容易被枯氏細胞和肝竇內(nèi)皮細胞內(nèi)吞，從而誘導炎癥反應和細胞凋亡。

本文對于理解GO 對肝臟的潛在毒性作用具有相當重要的意義，但目前的研究是在體外條件下采用靜態(tài)二維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，無法反映肝臟的動態(tài)血流和三維結(jié)構(gòu)，存在一定的局限性，因此，有必要進行體內(nèi)實驗來驗證體外實驗結(jié)果，從而有助于開發(fā)應用于生物醫(yī)學的更安全的GO 材料。

4 結(jié)束語

本文證明了GO 的氧化狀態(tài)和橫向尺寸在三種主要肝臟細胞類型的細胞死亡機制和炎癥反應中的關鍵作用。pGO 通過枯氏細胞的細胞膜損傷誘導細胞死亡 (pGO-L>pGO-S)，在肝竇內(nèi)皮細胞和肝細胞中未檢測到細胞毒性和炎癥反應。相比之下，rGO在枯氏細胞和肝竇內(nèi)皮細胞攝取后通過溶酶體損傷誘導細胞凋亡 (rGO-L>rGO-S)。此外，rGO 在枯氏細胞和肝竇內(nèi)皮細胞中觸發(fā)IL-1β 分泌，但對肝細胞的影響較小。本文為探索GO 對肝臟毒性作用提供了實驗數(shù)據(jù)，并為GO 在生物醫(yī)學方面的應用提供了理論支持。