FOXM1688-748 結構域相互作用蛋白的鑒定

譚擁軍，楊仕平，余靂，黃小芹，陳燕，譚桂湘

（湖南大學 生物學院，湖南 長沙 410082）

FOXM1（Forkhead box M1）是轉錄因子FOX 家族的成員，該家族成員都有一個保守的翼狀螺旋DNA 結合結構域[1].FOXM1 幾乎在所有腫瘤細胞中高表達，是基因表達和細胞循環機制以及其他重要生理過程的關鍵調節器[2]，參與腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、轉移、上皮-間質轉化、腫瘤血管生成、防止細胞過早衰老等過程[3-7]，它與癌癥的發生和發展存在著至關重要的關系，已被確立用于癌癥診斷、治療和預后[8].FOXM1 蛋白主要包含3 個結構域，分別是保守的DNA 結合結構域（DBD）、N-端抑制結構域（NRD）、C-端轉錄激活結構域（TAD）[9].FOXM1 激活靶基因轉錄的機制中，通過直接結合靶基因啟動子后招募其他共激活因子，激活基礎轉錄機器，從而啟動轉錄[10].通常情況下，FOXM1 的N-端抑制結構域與C-端轉錄激活結構域相互作用，抑制FOXM1 的轉錄活性[11-12].FOXM1 需要發揮轉錄激活作用時，主要依賴細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）和PLK1 激酶，對FOXM1 的TAD 進行磷酸化，使TAD 構象發生變化，誘導NRD 釋放TAD.隨后磷酸化的TAD 可募集共激活劑CBP，實現激活基因轉錄[13].

目前，已發現FOXM1 與許多蛋白發生相互作用.一些互作蛋白作為FOXM1 的正調節因子，通過激活FOXM1 的功能，增強其在癌細胞中的活性，如NPM、MELK、Pin1 等蛋白[14].另一些互作蛋白可作為FOXM1 的負調節因子，通過抑制FOXM1 的功能來減弱其在癌細胞中的活性.如在蛋白毒性應激下，HSP70 與FOXM1 的相互作用抑制了FOXM1 的DNA 結合能力[15].此外，FOXM1 與其他蛋白相互作用，發揮介導這些蛋白激活或增強其致癌通路的功能.如在膠質瘤細胞中，FOXM1 直接結合β-catenin，增強了β-catenin 的核定位和轉錄活性，從而激活WNT 信號通路[16].

近幾十年來，對FOXM1 的轉錄激活研究較多集中在其轉錄激活結構域的氨基酸修飾上，而對直接調控轉錄激活結構域的研究較少.為了拓展FOXM1 轉錄激活結構域對其轉錄活性影響的認識，本文通過體外純化該結構域的方法，來研究其他可能通過TAD 結構域調控FOXM1 轉錄活性的機制，這對揭示FOXM1 蛋白的分子功能具有重要的生物學意義.

1 材料與方法

1.1 材 料

質粒pGEX-4T2、FOXM1 CDS 序列由本實驗室保存；乳腺癌細胞MDA-MB-231 購自美國模式培養物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC）；胎牛血清（FBS）購自GIBCO 公司；感受態細胞DH5α、BL21 Rosetta（DE3）、DNA 聚合酶、PCR 引物、1 kb DNA maker 購自北京擎科生物技術有限公司；T4 DNA 連接酶購自Ferments 公司；限制性內切酶XhoI、BamH1 購自Thermo Fisher 公司；Glutathione Sepharose 4B 珠子、GST 抗體、Rabbit 二抗購自碧云天生物技術公司；Mouse 二抗購自Bio-Rad 公司；FOXM1 抗體購自CST（cell signaling technology）公司；BAG2 抗體購自上海生工生物工程股份有限公司.

1.2 方 法

1.2.1 pGEX-4T2-FOXM1688-748載體的構建

在NCBI 中檢索FOXM1 的CDS 區序列，截取其第688 位到748 位氨基酸對應的核苷酸序列并結合載體pGEX-4T2 的MCS 位點確定FOXM1688-748的引物.其上游引物為GCGGATCCATGTCCCCG GAGCCACAGGTT，下游引物為GCCTCGAGCTA CTGTAGCTCAGGAAT，劃線部分為限制性內切酶BamH1、XhoI 的酶切位點.以FOXM1 的CDS 序列為模板，擴增出FOXM1688-748片段.擴增條件為98 ℃，2 min；98 ℃，10 s；60 ℃，15 s；72 ℃，15 s；35 個循環.將PCR 產物克隆入pGEX-4T2 空載體中，經BamH1、XhoI 雙酶切鑒定后送擎科生物有限公司測序.

1.2.2 重組蛋白GST-FOXM1688-748的表達和純化

將pGEX-4T2-FOXM1688-748、pGEX-4T2 質粒轉化入感受態細胞BL21 中，挑選陽性單克隆，加入含有氨芐的LB 培養基中，37 ℃、220 r/min，擴大培養至OD 值為0.6～0.8 的產物，加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG，28.5 ℃誘導過夜，4 000 r/min，離心20 min，收集菌體，加入終質量濃度為200～400 mg/mL 溶菌酶冰上裂解30 min.超聲破碎，離心收集上清，加入GST 珠子，4 ℃孵育2 h.離心棄上清，用PBS 將珠子洗5 遍，GST Elution Buffer 洗脫純化的蛋白，收集蛋白并用考馬斯亮藍染色檢測其純化效果.

1.2.3 細胞培養

MDA-MB-231 細胞用體積分數為10%的FBS和1%雙抗（100 mg/L 青霉素和鏈霉素）的DMEM 完全培養基培養，置于37 ℃、體積分數為5%的CO2、相對濕度為90%的細胞培養箱中培養，當MDA-MB-231 細胞密度達到90%后用于Pulldown 實驗.

1.2.4 GST-pulldown

收集MDA-MB-231 細胞，加入500 μL 的IP 裂解液，以體積比1 ∶100 的比例加入蛋白酶抑制劑，冰上裂解1 h，12 000 r/min，離心5 min，收集上清.加入30 μL GST 珠子，4 ℃預孵育1 h.1 000 r/min 離心2 min，收集上清，一分為二，分別加入50 μg 原核純化的GST、GST-FOXM1688-748蛋白、30 μL GST 珠子，4 ℃孵育2 h.1 000 r/min，離心2 min 收集GST 珠子，用預冷的PBS 漂洗4 次，加入30 μL 1xLoading Buffer，98 ℃變性15 min 后進行SDS-PAGE 和考馬斯亮藍檢測.

1.2.5 質譜分析

將Pulldown 拖下來的蛋白通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分離后，切下來送上海胡珀生物有限公司打質譜.將實驗組與對照組蛋白去重后，選擇質譜分數大于2 的蛋白用UniProtKB 在線網站（https：//www.uniprot.org/）分析分子功能，將結果進行整理和歸類，得到不同功能的蛋白.為了驗證質譜結果的可靠性，挑選潛在的互作蛋白BAG2 進行互作驗證，方法同1.2.3 節中的方法.

2 結果與分析

2.1 pGEX-4T2-FOXM1688-748 載體的構建

以FOXM1 CDS 序列為模板，擴增出FOXM1688-748目的條帶，其大小為200 bp 左右（圖1（a））.將該片段克隆入經酶切后的pGEX-4T2 載體中，進行菌落PCR 和雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示其在100～300 bp 有明顯的條帶（圖1（b）（c）），pGEX-4T2-FOXM1688-748載體示意圖如圖1（d）所示.將構建好的載體進行序列比對，結果顯示與本文設計結果相同（圖1（e））.由此可知，本文成功構建了pGEX-4T2-FOXM1688-748原核表達載體.

圖1 pGEX-4T2-FOXM1688-748 質粒的構建及鑒定Fig.1 Construction and identification of pGEX-4T2-FOXM1688-748 plasmid

2.2 重組蛋白GST-FOXM1688-748 的表達與純化

將克隆成功的pGEX-4T2-FOXM1688-748質粒轉化入大腸桿菌感受態細胞BL21 Rosetta，挑選陽性單克隆擴大培養，用GST 珠子純化，考馬斯亮藍染色展示純化結果如圖2 所示.由圖2 可知，GST 和GSTFOXM1688-748蛋白的純化效果較好，并且可以得到較高濃度的GST、GST-FOXM1688-748蛋白，為后續的Pulldown 實驗提供實驗材料.

圖2 重組蛋白GST 和GST-FOXM1688-748 考馬斯亮藍染色Fig.2 Coomassie blue staining of GST and GST-FOXM1688-748 proteins

2.3 FOXM1688-748 與FOXM1 全長蛋白相互作用

為了驗證FOXM1688-748與FOXM1 全長蛋白的作用關系，通過GST-pulldown 的方法來驗證它們的相互作用.用預清除的MDA-MB-231 細胞裂解液分別與GST、GST-FOXM1688-748重組蛋白孵育，用FOXM1、GST 抗體進行免疫印記檢測.重組蛋白GSTFOXM1688-748可以拖下其全長蛋白FOXM1，而GST蛋白在同一位置未檢測到FOXM1 條帶，表明FOXM1688-748可以與其全長相互作用（圖3），證實了純化的重組蛋白FOXM1688-748具有良好的生物活性.

圖3 Pulldown 結果及Western blot 分析Fig.3 Pulldown result and Western blot analysis

2.4 FOXM1688-748 互作蛋白的鑒定

為了研究FOXM1688-748可能的生物學作用，將GST-pulldown 拖下來的蛋白送公司進行質譜鑒定，取質譜分數大于2 的蛋白進行分析，得到112 個蛋白，其中有2 個蛋白已被證明與FOXM1 的轉錄激活結構域互作，分別是CDK1 和FOXM1.對質譜中的蛋白進行分類和整理，發現這些蛋白分子功能較多集中于蛋白質的加工和分泌、細胞周期和分裂、翻譯過程（圖4）.在蛋白質的加工和分泌方面，捕獲到的蛋白有HSP90AB1、HSPB1、BAG2、USP9Y、DERL1、UBB、FAM129A 等，其中HSP90AB1、HSPB1、BAG2與蛋白質的折疊有關，USP9Y、DERL1、UBB 與蛋白質的泛素化有關，FAM129A 參與翻譯后蛋白質的磷酸化.在細胞周期和分裂方面，捕獲到的蛋白有CDK1、FOXM1、MCM7、RPN2、MISP、NCAPG 等，這些蛋白在細胞分裂過程中發揮了重要的作用.在翻譯方面，捕獲到的蛋白有GCN1、RACK1、LARS、DDX39A、HNRNPA0 等，GCN1、RACK1、LARS 參與蛋白質的合成過程，而DDX39A、HNRNPA0 分別參與mRNA 的前期剪接和細胞因子mRNA 的轉錄后調控.

圖4 互作蛋白的功能分析Fig.4 Functional analysis of interacting proteins

2.5 FOXM1688-748 與BAG2 的互作驗證

為了驗證質譜結果的可靠性，從質譜中挑選潛在的互作蛋白BAG2 進行互作驗證.在Pulldown 實驗結果中，原核表達的FOXM1688-748可與MDA-MB-231 細胞中內源的BAG2 相互作用（圖5）.上述結果證實了質譜結果的可靠性，并為研究FOXM1 C 端互作蛋白的功能及分子機制提供實驗依據.

圖5 FOXM1688-748 與BAG2 互作Fig.5 FOXM1688-748 interacts with BAG2

3 討論

Pulldown 是一種廣泛用于體外檢測兩種或多種蛋白質之間的物理相互作用的方法，以確認預測的蛋白質-蛋白質之間的相互作用或捕獲新的互作蛋白[17].在這項研究中，本文成功純化了FOXM1 轉錄激活結構域FOXM1688-748，并利用Pulldown 實驗證實它能夠與FOXM1 全長蛋白互作，這是由于FOXM1的NRD 可以與其TAD 相互作用[11].由于內源FOXM1的TAD 需要在細胞周期蛋白依賴性激酶的磷酸化后才能被NRD 釋放，為了直接獲得與FOXM1 轉錄激活結構域相互作用的蛋白，利用GST-pulldown 方法，在不受NRD 影響的情況下，通過質譜鑒定得到一系列與其相互作用的蛋白.FOXM1 在腫瘤的發生發展中具有至關重要的作用，這離不開各種互作蛋白對FOXM1 的翻譯后調控.在質譜結果中，我們捕獲到一些已知的FOXM1 互作蛋白，如CDK1.在細胞分裂的S 期或M 期，CyclinB1/CDK1 復合物結合FOXM1 的轉錄激活結構域，誘導CDK1 磷酸化FOXM1，磷酸化后的FOXM1 招募共激活因子CBP，從而激活FOXM1 的轉錄活性[10].根據質譜結果中蛋白質的功能，預示RPN2、MISP、MCM7、FAM129A 蛋白可能參與調節FOXM1 的轉錄活性.

除了對FOXM1 翻譯后的修飾實現的調控外，一些互作蛋白還可以參與維持FOXM1 蛋白的穩定性，它們通過對FOXM1 的去泛素化作用來增強FOXM1的穩定性，如USP21.在基底樣乳腺癌細胞中，USP21與FOXM1 互作，使FOXM1 去泛素化免受蛋白酶體的降解[18].質譜結果中也存在一些泛素化分子，如USP9Y、CUL4A，預示這些蛋白參與FOXM1 蛋白的泛素化或去泛素化，從而調節其蛋白質的穩定性.此外，一些與蛋白質折疊有關的分子伴侶也出現在質譜結果中，如HSPB1、USP9Y、BAG2.Pulldown 實驗也證實BAG2 與FOXM1 的互作，預示這些蛋白可能通過對FOXM1 蛋白的折疊來維持其穩定性.

FOXM1 作為經典的轉錄因子，其主要的功能是結合到下游靶基因的啟動子上，招募一些轉錄復合體，實現對靶基因的轉錄激活[19].質譜中也出現了一些與轉錄相關的蛋白，如RuvBL1.RuvBL1 是NuA4組蛋白乙酰轉移酶復合物的成分，主要通過對核小體組蛋白H4 和H2A 的乙?；瘏⑴c靶基因的轉錄激活，這種修飾既可以改變核小體與DNA 的相互作用，又可以促進修飾的組蛋白與其他可正向調節轉錄的蛋白質的相互作用[20].預示RuvBL1 可能被招募到轉錄復合體中，參與FOXM1 對下游靶基因的激活.

綜上所述，利用FOXM1688-748重組蛋白為原料，通過Pulldown 結合質譜的方法獲得了FOXM1 轉錄激活結構域的潛在互作蛋白，并對這些潛在互作蛋白的分子功能進行分析歸類.這為后續研究FOXM1轉錄激活結構域的互作蛋白提供可靠的實驗依據，對探究FOXM1 分子的生物學功能具有重要的意義.