乙型肝炎病毒促進肝細胞PD-L1 蛋白表達機理

朱海珍，荀圳，鄧日林，田仁云，郭萌萌，陳生穩，劉倩，郭艷霞

（1.湖南大學 生物學院，湖南 長沙 410082；2.湖南大學 病原生物學與免疫學研究所，湖南 長沙 410082；3.湖南大學 醫學病毒學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410082）

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是一種小的嗜肝DNA 病毒，是導致慢性肝病的主要原因，可導致病毒性肝炎、肝硬化和肝細胞癌（Hepatic cell carcinoma，HCC）.據統計，全世界約有2.5 億人長期感染HBV，并有發展為肝硬化甚至肝癌的風險[1].病毒和宿主因素都對慢性HBV 感染的結果有影響，與其他病原體一樣，HBV 形成了逃避宿主的免疫防御策略，例如高比率的基因突變率和免疫調節蛋白的表達.

軸抑制蛋白Axin 是Wnt/β-catenin 信號的負調節因子，通過蛋白酶體降解途徑調節β-catenin 蛋白水平，進而抑制Wnt/β-catenin 信號轉導[2-4].然而，Axin 在HBV 感染過程中的作用尚不清楚.

PD-L1 是一種免疫檢查點分子，調節Ⅰ型T 輔助細胞（Th1）免疫反應，介導癌癥免疫逃避.它可以在腫瘤細胞（TC）和腫瘤浸潤性的免疫細胞（IC）上進行表達[5].近幾年，抗PD-L1 治療手段在人類癌癥的免疫治療中占據了中心地位[6-8].然而，PD-L1 在HBV感染中的作用及其機理仍有待闡明.

泛素蛋白酶體降解途徑是目前已知的所有真核生物體內具有高度選擇性且最為重要的蛋白質降解途徑.真核細胞內泛素化修飾后的靶蛋白能被降解或者被轉移到細胞內或細胞外的特定部位.靶蛋白的泛素化修飾需要E3 泛素連接酶的參與，E3 泛素連接酶通過調控調節蛋白的泛素化過程參與細胞內的多種生理過程[9].經研究發現，HBV 感染可對細胞內多種生命活動產生影響，如影響轉錄因子的表達，促使Caspase 剪切從而促使細胞凋亡等.然而，HBV是否能調節細胞內一些E3 連接酶的表達，進而調節泛素蛋白酶體途徑尚不清楚.

本文從轉錄水平、翻譯水平以及翻譯后的修飾水平對Axin 和PD-L1 的關系進行了探討，發現Axin 可能通過調節PD-L1 的E3 連接酶的表達，調控PD-L1 的翻譯后修飾；同時，還發現Axin 能夠逆轉HBV 引起的PD-L1 上調現象.本研究為HBV 免疫逃逸機理提供參考和依據.

1 材料與方法

1.1 細胞系

Huh7 細胞為美國耶魯大學醫學院劉晨教授實驗室惠贈；BGC-823 購自Boster 公司；HEK293T 購自美國ATCC；HLCZ01 細胞系由本實驗室從臨床病人肝組織中分離培養得到[10].

1.2 試 劑

高糖（DMEM）培養基和DMEM/F-12 培養基（Invitrogen 公司），1×PBS（Hyclone 公司），0.25%胰蛋白酶（Invitrogen 公司），細胞RNA 收取Trizol 試劑（Invitrogen 公司），逆轉錄試劑盒（Accurate Biology 公司），SYBR Green 定量試劑盒（Accurate Biology 公司），蛋白酶抑制劑片劑（Merck 公司），細胞蛋白收取RIPA 裂解液（Thermo 公司），Axin 抗體（CST 公司），PD-L1 抗體（Proteintech 公司），Flag 抗體（Sigma-Aldrich 公司），V5 抗體（Invitrogen 公司），β-actin 抗體（Sigma-Aldrich 公司）.

60 mm 的細胞培養皿（Biologix 公司），十二孔細胞培養板（Biologix 公司），10 cm 的細胞培養皿（Biologix 公司），1.5 mL 的離心管（Axygen 公司），200 μL PCR 八聯管（Axygen 公司），0.22 μm 和0.45 μm 的PVDF 膜（Merck Millipore 公司）.

1.3 儀器設備

4 ℃冰箱（中科美菱公司），-20 ℃冰箱（Haier 公司），-80 ℃超低溫冰箱（Thermo 公司），CO2恒溫細胞培養箱（Thermo 公司），生物安全柜（Airtech 公司），凝膠核酸成像（上海天能公司），蛋白核酸曝光成像儀器（Bio-rad 公司），細胞計數儀（Beckman 公司），光學顯微鏡（Olympus 公司），細胞液氮凍存罐（Thermo 公司），分析天平（上海天平儀器廠），Nanodrop2000（Thermo 公司），實時熒光定量PCR 儀（湖南達爾儀器有限公司），普通PCR 儀（Eppendorf 公司），制冷高速離心機（Eppendorf 公司）.

1.4 實驗方法

1.4.1 HBV 感染方法

用于實驗感染細胞的HBV 來自HepG2.2.15 細胞上清（D 型）.在培養HepG2.2.15 細胞時，在培養基中加入終質量濃度為500 μg/mL 的新霉素（G418）來維持HBV 基因組的復制水平.當HepG2.2.15 細胞開始產生病毒時，用不加G418 的培養基培養HepG2.2.15 細胞，一邊擴大培養細胞一邊收集細胞上清，收集的細胞上清用0.45 μm 微孔過濾器過濾，使病毒得以富集，最后測定病毒滴度.HBV 按照MOI為20 接種于HLCZ01 細胞，病毒與細胞孵育過夜后，去除培養上清，用磷酸鹽緩沖鹽水（Phosphate Buffered Saline，PBS）洗滌3 次，加入新鮮培養基繼續培養至對應的時間點.

1.4.2 過表達質粒的構建與鑒定

為了構建Axin、PD-L1、SPOP、Cbl 和HBX 的過表達質粒，首先利用Primer Primer5 設計PCR 引物，然后從Huh7 細胞中提取總RNA，利用其逆轉錄產物為模板來擴增Axin、PD-L1、SPOP、Cbl 基因；同時從HBV 感染的HLCZ01 細胞內提取細胞總RNA 來擴增HBX 基因.通過膠回收純化PCR 產物，最后利用TA 克隆方法將擴增得到的DNA 片段連入p3×Flag-CMV 和pCDNA3.1a 載體中，從而得到重組質粒p3×Flag-CMV-Axin、p3×Flag-CMV-PD-L1、p3×Flag-CMV-HBx、pCDNA3.1a-PD-L1、pCDNA3.1a-SPOP、pCDNA3.1a-Cbl，通過測序鑒定目的基因序列是否完全正確.PCR 引物序列如表1 所示.

表1 質粒克隆引物Tab.1 Primers used for plasmid construction

1.4.3 Western blot 實驗

用含有蛋白酶抑制劑的RIPA Buffer 裂解液裂解細胞，冰浴30 min，13 200 r/min 離心15 min 后收集蛋白.根據試劑說明書的使用方法，用BCA（Bicinchoninic Acid）試劑法測定蛋白濃度.取20 μg蛋白樣品與2×Load Buffer 等體積混合，在100 ℃金屬浴中煮沸5 min 之后上樣，采用80 V 恒壓跑膠，待蛋白Mark 分層后調至120 V 恒壓跑膠，根據Mark顯示的位置，待目的蛋白到達合適位置后進行轉膜.100 V 恒壓轉膜2 h，轉膜成功后，以5%的脫脂牛奶封閉1 h，之后加入對應一抗4 ℃過夜孵育，二抗選用anti-mouse 或anti-rabbit 抗體室溫孵育2～4 h.將PVDF 膜置于化學發光信號檢測儀上，加入預先配制好的顯影液曝光1～5 min，并保存蛋白印跡圖片.

1.4.4 Real-time PCR 實驗

使用Trizol 試劑裂解細胞，采用氯仿抽提的方法提取細胞內總RNA，通過逆轉錄獲得cDNA，用相對應的定量引物進行實時熒光定量PCR 分析，探究目的基因在RNA 水平的表達情況，所用方法參照試劑盒說明書操作.Real-time PCR 反應所用引物序列如表2 所示.

表2 Real-time PCR 反應所用引物序列Tab.2 Primer sequences used in real-time PCR reactions

1.4.5 統計學分析

所有實驗數據均錄入Excel 文檔中保存，對照組數據和處理組數據之間顯著性差異分析采用學生雙尾t 值分析方法.用*P＜0.05、**P＜0.01 和***P＜0.001 來表示顯著性差異程度，其中P＜0.05 被認為具有統計學意義.數據以means±SD 形式在圖表中顯示.

2 結果與結論

2.1 HBV 感染抑制Axin 的表達和促進PD-L1 的表達

Axin 在WNT 信號通路中起重要的調控作用[11]，為了檢測Axin 在HBV 調節抗病毒免疫過程中的作用，本文檢測了HLCZ01 細胞和HBV 感染的HLCZ01 細胞內Axin 和PD-L1 的表達，以探討Axin在HBV 感染過程中的潛在作用.利用實時熒光定量（Real-time PCR）方法，以MOI 為20 的HBV 感染HLCZ01 細胞45 d，提取細胞總RNA 和細胞總蛋白.利用Real-time PCR 方法，以未被HBV 感染的HLCZ01 細胞為對照，檢測細胞內Axin 和PD-L1 的mRNA 水平，發現HBV 感染后不影響Axin 和PDL1 的轉錄水平（圖1（a））.利用Western Blot 方法，檢測細胞內Axin 和PD-L1 的蛋白水平，發現HBV 感染后抑制Axin 蛋白的表達但促進PD-L1 蛋白的表達（圖1（b））.為進一步驗證這一實驗結果，在Huh7細胞中轉染表達HBV 的1.3 倍復制子的質粒，24 h以后提取細胞總RNA 和細胞總蛋白.利用Realtime PCR 方法，檢測細胞內Axin 和PD-L1 的mRNA水平，發現HBV 的1.3 倍復制子抑制Axin 的轉錄但不影響PD-L1 的轉錄（圖1（c））.借助Western Blot方法，發現轉染了HBV 的1.3 倍復制子質粒的Huh7細胞內的Axin 蛋白水平明顯下調，而PD-L1 的蛋白水平明顯上調（圖1（d））.在Huh7 細胞中轉染質粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-HBx，48 h 后收取細胞總蛋白，利用Western Blot 方法，檢測細胞內Axin 和PD-L1 的蛋白水平，發現轉染了HBx 質粒的Huh7 細胞內Axin 的蛋白水平下降，而PD-L1的蛋白水平升高（圖1（e））.基于上述實驗結果，推測HBV 導致Axin 和PD-L1 蛋白水平發生變化可能是通過HBx 實現的.此外，以MOI 為20 的HBV 感染HLCZ01 細胞45 d，然后轉染質粒p3×Flag-CMVvector 或p3×Flag-CMV-Axin（1 μg 或2 μg），48 h 后收取細胞總蛋白，利用Western Blot 方法，檢測細胞內Axin 過表達情況和PD-L1 蛋白水平，研究發現在HBV 感染的HLCZ01 細胞內過表達Axin 質粒，能夠逆轉HBV 感染引起的PD-L1 蛋白水平降低現象（圖1（f））.由圖1 可知，在HBV 感染肝細胞內，Axin蛋白水平與PDL1 蛋白水平呈負相關性.

圖1 HBV 感染抑制Axin 的表達和促進PD-L1 的表達Fig.1 HBV infection inhibits Axin expression and promotes PD-L1 expression

2.2 Axin 通過泛素化蛋白酶體途徑降解PD-L1蛋白

為了進一步明確Axin 與PD-L1 之間的關系，在Huh7 細胞中，轉染質粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin，48 h 后收取細胞總蛋白，利用Western Blot 方法，檢測細胞內Axin 和PD-L1 蛋白水平，發現Axin 可降低細胞內PD-L1 蛋白水平（圖2（a））.在Huh7 和HEK293T 細胞中，轉染質粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin，48 h 后收取細胞總RNA，利用Real-time PCR 方法，檢測細胞內Axin 和PD-L1 的mRNA 水平，發現在Huh7 和293T 細胞中過表達Axin 對PD-L1 的轉錄水平并無明顯影響（圖2（b））.利用從湖南省腫瘤醫院收集48例肝癌病人癌旁組織樣本，提取組織總RNA，利用Real-time PCR 方法，檢測組織內Axin 和PD-L1 的mRNA 水平，并通過SPSS 軟件分析Axin 與PD-L1之間的相關性，發現它們的mRNA 并無相關性（圖2（c））.在Huh7 細胞中，轉染質粒p3×Flag-CMVvector 或p3×Flag-CMV-Axin，48 h 后加入放線菌酮素（100 μg/mL CHX 終濃度），15 min 和30 min 后分別收取細胞總蛋白，利用Western Blot 方法，檢測細胞內Axin 過表達情況和PD-L1 蛋白水平，發現Axin 對PD-L1 的翻譯水平沒有影響（圖2（d））.最后，對其翻譯后修飾水平進行探究.在Huh7 細胞中，轉染質粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin，48 h 后分別加溶酶體降解途徑抑制劑（NH4Cl）[12]和蛋白酶降解途徑抑制劑（MG132），處理6 h 后收取細胞總蛋白，利用Western Blot 方法，檢測細胞內Axin過表達情況和PD-L1 的蛋白水平，發現Axin 可能通過影響PD-L1 的蛋白酶體降解發揮作用（圖2（e））.另外，在HEK293T 細胞中，轉染質粒p3×Flag-CMVvector 或p3×Flag-CMV-Axin 和pCDNA3.1a-PDL1，48 h 后加蛋白酶降解途徑抑制劑（MG132），處理6 h 后收取細胞總蛋白，以V5 抗體進行免疫共沉淀實驗，檢測細胞內PD-L1 的泛素化水平，發現Axin能促進PD-L1 的泛素化（圖2（f）（g））.在Huh7 細胞中，轉染質粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin（1 μg 或者2 μg）48 h 后，在收取蛋白前6 h，加入蛋白酶降解途徑抑制劑（MG132）培養細胞，收取的細胞總蛋白以PD-L1 抗體進行免疫共沉淀實驗，檢測細胞內PD-L1 的泛素化水平，發現Axin 對PD-L1 的泛素化呈劑量依賴性.基于上述實驗結果，認為Axin 可能通過蛋白酶體途徑降解PD-L1 蛋白.

圖2 Axin 通過泛素化蛋白酶體途徑降解PD-L1 蛋白Fig.2 Axin degrades PD-L1 protein through ubiquitin proteasome pathway

2.3 Axin 通過影響E3 連接酶SPOP 的表達進而調控PD-L1 的蛋白酶體降解

蛋白與蛋白質之間的相互作用可能是通過直接或間接方式進行的.為明確Axin 對PD-L1 蛋白的調控方式，首先，在HEK293T 細胞中共轉染帶Flag 標簽的Axin 和帶V5 標簽的PD-L1，通過免疫共沉淀實驗分析，發現Axin 與PD-L1 不存在直接相互作用（圖3（a））.間接調節PD-L1 的泛素化作用可能通過兩種方式，一種是調節其去泛素化酶的表達，另外一種是調節其泛素化酶的表達.NF-kb 信號通路活化后，可增強PD-L1 去泛素化酶的表達[13].將質粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin 轉染至Huh7 細胞，48 h 后分別收取細胞總蛋白，利用Western Blot 和實時熒光定量PCR 方法，發現Axin對NF-kb 信號通路的活化無作用（圖3（b））.有文獻報道E3 連接酶Cbl 和SPOP 可泛素化降解PDL1[14-18].將質粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin 轉染至Huh7 細胞，48 h 后收取細胞總RNA，利用Real-time PCR 方法，檢測Axin 對PD-L1的E3 連接酶Cbl 和SPOP 的mRNA 水平的影響，發現Axin 對這兩種E3 連接酶的mRNA 水平并無影響（圖3（c））.另外，將質粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMV-Axin（1 μg 或者2 μg）和pCDNA3.1a-Cbl或者pCDNA3.1a-SPOP 轉染至HEK293T 細胞，48 h后收取細胞總蛋白，利用Western Blot 方法，檢測Axin 對Cbl 和SPOP 蛋白水平的影響，發現Axin 可增強SPOP 的蛋白表達（圖3（d））.有文獻報道PDL1 主要通過K48 位和K63 位進行泛素化降解[19-21]，將質粒p3×Flag-CMV-vector 或p3×Flag-CMVAxin 和pCDNA3.1a-PD-L1 和野生型、K48 或者K63的HA 質粒轉染至HEK293T 細胞，以V5 抗體進行免疫共沉淀實驗，檢測其對PD-L1 蛋白泛素化的影響，發現Axin 促進K48 依賴的PD-L1 泛素化降解（圖3（e））.

綜上所述，本文認為HBV 可能通過其HBx 下調Axin 蛋白水平，降低PD-L1 的E3 連接酶SPOP 蛋白水平，進而抑制K48 依賴的PD-L1 泛素化降解，導致HBV 感染肝細胞內PD-L1 蛋白含量增加（圖3（f））.

圖3 Axin 通過影響E3 連接酶SPOP 的表達進而調控PD-L1 的蛋白酶體降解Fig.3 Axin regulates proteasome degradation of PD-L1 by affecting the expression of E3 ligase SPOP

3 討論

在HBV 誘導的肝細胞癌中，癌組織中的Axin蛋白水平明顯低于其鄰近組織，但HBV 下調Axin蛋白表達的機制尚不明確.本文對HBV 抑制Axin蛋白表達的機制進行了研究，發現HBx 可能參與了HBV 對Axin 蛋白水平的下調作用.文獻[22-24]研究表明，在乙型肝炎病毒相關性肝癌組織中，CD8+T 細胞功能異常且耗竭，其特征是PD-1 高表達，干擾素-γ 和腫瘤壞死因子分泌減少，但HBV 感染誘導細胞內PD-L1 表達的機制仍不清楚.本文研究發現在HBV 感染的肝細胞內，Axin 蛋白表達明顯下調而PD-L1 蛋白表達顯著增加.通過相關細胞實驗和臨床數據統計表明，Axin 不能調節WNT 信號通路下游轉錄因子的表達進而影響PD-L1 的轉錄水平.另外，一個蛋白影響另外一個蛋白的表達，也有可能是調節它翻譯后的降解水平來實現的.通過添加相關抑制劑，發現Axin 通過影響PD-L1 的蛋白酶體降解途徑，降低病毒感染細胞內PD-L1 水平.進一步研究發現Axin 可能通過影響PD-L1 的E3 連接酶SPOP 的表達，進而發揮其促進PD-L1 泛素化降解作用，但Axin 影響SPOP 表達的具體機制仍有待進一步研究.另外，本研究只選擇了與PD-L1 相關的兩種E3 連接酶進行了研究，Axin 是否對作用于PDL1 的其他E3 連接酶有影響還有待進一步探討.