基于納米壓痕技術(shù)研究藥物對(duì)胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞機(jī)械特性的影響

王文思，員瑜，王佳敏，施佳林，蹇林格，趙瀅，張?zhí)毂?/p>

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，沈陽 110122；2.中國(guó)科學(xué)院沈陽自動(dòng)化研究所機(jī)器人研究室，沈陽 110016；3.四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610041；4.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院胃腸營(yíng)養(yǎng)外科，沈陽 110004）

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是胃腸道最常見的間葉源性惡性腫瘤［1］。1983年，美國(guó)病理學(xué)家MAZUR和CLARK首先提出了GIST的概念［2］。GIST每年發(fā)病率約為10/100萬～20/100萬［3］，常發(fā)生在50歲以上人群。在約80%的GIST中發(fā)現(xiàn)致癌的c-kit突變，其11號(hào)外顯子突變是GIST中最常見的致癌突變（67%）［4］，這些突變包括點(diǎn)突變、框內(nèi)缺失或插入，其余的突變?yōu)?號(hào)外顯子編碼突變（10%），13和17號(hào)外顯子中有較小程度的激活突變（＜2%）。約15%的GIST由血小板源性生長(zhǎng)因子受體α（platelet-derived growth factor receptor α，PDGFRα）多肽激活驅(qū)動(dòng)，12、14和18號(hào)外顯子顯示致癌突變。野生型GIST占GIST的5%～10%，不含c-kit或PDGFRα突變。由于受體酪氨酸激酶信號(hào)依賴，GIST可以用酪氨酸激酶抑制劑有效治療，如伊馬替尼、舒尼替尼和索拉非尼。盡管大多數(shù)患者的初始反應(yīng)良好，但隨著時(shí)間的推移，異質(zhì)性耐藥機(jī)制的發(fā)展，大多數(shù)患者的病情都有所進(jìn)展。目前進(jìn)行的研究旨在評(píng)估具有其他作用機(jī)制的藥物，單獨(dú)或與伊馬替尼或其他酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)合使用，以避免高耐藥率。有研究［5］顯示，靶向蛋白激酶B抑制劑MK-2206似乎不足以抑制GIST細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活，然而將MK-2206與伊馬替尼聯(lián)合使用可顯著提高療效。目前的數(shù)據(jù)表明，在GIST中靶向多個(gè)分子靶點(diǎn)比單一治療更有效，未來可嘗試在臨床中實(shí)踐應(yīng)用。

原子力顯微鏡利用探針接觸分子水平和細(xì)胞水平的樣品，可對(duì)生物體在近生理環(huán)境下進(jìn)行納米級(jí)成像及力學(xué)特性研究［6］。原子力顯微鏡由微懸臂、檢測(cè)系統(tǒng)、施加力和距離的反饋控制系統(tǒng)、壓電陶瓷控制的移動(dòng)系統(tǒng)、獲取數(shù)據(jù)與分析系統(tǒng)組成。許多疾病的起源可以從細(xì)胞的力學(xué)性質(zhì)來考慮，如細(xì)胞黏彈性的改變和楊氏模量的改變與癌癥轉(zhuǎn)移和惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。原子力顯微鏡的力學(xué)測(cè)量提供了一種潛在的、基于單細(xì)胞尺度進(jìn)行疾病診斷的新方法，探究其檢測(cè)過程中力學(xué)性質(zhì)的轉(zhuǎn)變與人類疾病進(jìn)展的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)而挖掘出力學(xué)檢測(cè)方法在藥效評(píng)估中的潛在價(jià)值［7］。

從患者體內(nèi)分離的原代細(xì)胞比已經(jīng)建立的來源相似的細(xì)胞系更適合于實(shí)驗(yàn)研究，可能更準(zhǔn)確地模擬患者情況，為體外藥物敏感性試驗(yàn)和設(shè)計(jì)個(gè)體化治療方案提供更好的工具。本研究成功建立原代GIST細(xì)胞，將伊馬替尼與舒尼替尼聯(lián)合用藥作為GIST新的治療方案，分析二者聯(lián)合有無協(xié)同增效作用，并利用原子力顯微鏡對(duì)原代培養(yǎng)的GIST細(xì)胞進(jìn)行藥物作用后機(jī)械特性測(cè)量，初步探討二者聯(lián)合作用的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

甲磺酸伊馬替尼片購自瑞士Novartis Pharma Schweiz AG公司，蘋果酸舒尼替尼膠囊購自意大利Pfizer公司，胎牛血清購自中國(guó)Gibco公司，RPMI-1640、胰酶、雙抗購自以色列BI公司，CCK-8試劑盒購自美國(guó)Invigentech公司，膠原酶購自美國(guó)Sigma公司，PCR引物的合成和序列測(cè)定由上海生工生物公司完成，QIAamp RNA Mini Kit、QIAGEN OneStep RTPCR Kit購自德國(guó)QIAGEN公司。伊馬替尼和舒尼替尼分別配制成2 000 μmol/L的母液，-80 ℃保存，使用時(shí)倍比稀釋至3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00 μmol/L濃度的工作液。

1.2 原代細(xì)胞培養(yǎng)

仔細(xì)剔除GIST組織外周可能污染和壞死的組織，標(biāo)本用D-Hanks液洗2次，再用含雙抗的無血清RPMI-1640沖洗5～6次。在培養(yǎng)皿中用無菌眼科剪將GIST組織中心剪成數(shù)個(gè)小組織塊（盡量避開血管），盡量剪碎。將剪碎的組織塊移到離心管中再次洗滌3次。加入2倍體積的1 mg/mL胰酶和1 mg/mL膠原酶，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化60 min。收集單個(gè)和小塊組織的瘤細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，洗滌3次，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件為含15%胎牛血清的RPMI-1640，置入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。第2天輕輕吸棄上清液，換新鮮培養(yǎng)液，此后每隔5 d換液或傳代1次。

1.3 PCR實(shí)驗(yàn)

采用QIAGEN RNeasy Mini Kit進(jìn)行GIST細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取。基因引物序列：c-kit8號(hào)外顯子，上游引物5’-CAGCAGTCTGACCTATGGC-3’，下游引物5’-GCTCAGCTCCTGGACAGAAA-3’；c-kit9號(hào) 外顯子，上游引物5’-GATTGATTGATTGATTTTCCTAG-3’，下游引物5’-GCAGGCAGAGCCTAAACATC-3’；c-kit11號(hào)外顯子，上游引物5’-CCAGAGTGCTCTAAT GACTGAGA-3’，下游引物5’-AAACAAAGGAAGCC ACTGGA-3’；c-kit13號(hào)外顯子，上游引物5’-TACTG CATGCGCTTGACATC-3’，下游引物5’-TAATCTAG CATTGCCAAAATCA-3’；c-kit17號(hào)外顯子，上游引物5’-CATCATTCAAGGCGTACTTTTG-3’，下游引物5’-TGCAGGACTGTCAAGCAGAG-3’；PDGFRα12號(hào)外顯子，上游引物5’-TCCAGTCACTGTGCTGCTTC-3’，下游引物5’-AAGACTCCCTTTTCCCTTGC-3’；PDGFRα14號(hào)外顯子，上游引物5’-ACTGGTTTTGGTTCCCAC AG-3’，下游引物5’-CAATGATTCGCAGCAACG-3’；PDGFRα18號(hào)外顯子，上游引物5’-ACCATGGATCA GCCAGTCTT-3’，下游引物5’-GGTCAGGCTCATCC TCCTTCA-3’。按照QIAGEN OneStep RT-PCR Kit說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增體系配制及PCR擴(kuò)增。

1.4 CCK-8法測(cè)定GIST細(xì)胞體外藥物敏感性

將生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)期的貼壁GIST細(xì)胞消化后轉(zhuǎn)移至離心管，1 000 r/min低速離心離心5 min，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、伊馬替尼組、舒尼替尼組和聯(lián)合用藥組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每孔加入稀釋好的細(xì)胞懸液。接種48 h，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好后吸出各孔培養(yǎng)基。分別加入31.25 μmol/L伊馬替尼、15.63 μmol/L舒尼替尼以及31.25 μmol/L伊馬替尼和15.63 μmol/L舒尼替尼聯(lián)合處理的細(xì)胞生長(zhǎng)液，放入孵箱分別培養(yǎng)24、48和72 h。藥物處理相應(yīng)時(shí)間后，加入10% CCK-8溶液，放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)3 h，待培養(yǎng)基液體變?yōu)槌壬纯煞湃朊笜?biāo)儀檢測(cè)。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)定為450 nm，測(cè)定吸光度值，分析數(shù)據(jù)。

1.5 原子力顯微鏡檢測(cè)GIST細(xì)胞楊氏模量

應(yīng)用Icon 原子力顯微鏡（美國(guó)Veeco）和MLCT探針（彈性系數(shù)為0.01 N/m），以2 μm/s的速率在近生理?xiàng)l件下，測(cè)定藥物作用前后原代培養(yǎng)的GIST細(xì)胞的楊氏模量，即細(xì)胞機(jī)械彈性。逼近曲線記錄了探針在逼近接觸細(xì)胞并在細(xì)胞表面產(chǎn)生壓痕的過程，回退曲線記錄了探針從細(xì)胞表面回退到原始位置的過程。分析逼近曲線，計(jì)算不同藥物處理后GIST細(xì)胞的楊氏模量值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組測(cè)量5個(gè)GIST細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞壓10條以上力曲線。

根據(jù)計(jì)算公式（1）和（2）可知需要測(cè)量得到懸臂梁的偏轉(zhuǎn)量x和壓痕深度δ，其余的參量為已知的或是通過實(shí)驗(yàn)測(cè)量得到的［8］。應(yīng)用Nanoscope ⅣAFM系統(tǒng)和商用Nanoscope軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GIST細(xì)胞原代培養(yǎng)

取瘤組織消化后進(jìn)行培養(yǎng)，于倒置顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)的GIST細(xì)胞呈梭型、多角形、核大，互不重疊，呈單層生長(zhǎng)。見圖1。

圖1 GIST細(xì)胞倒置顯微鏡下圖像Fig.1 Inverted microscopic image of gastrointestinal stromal tumor cells

2.2 外顯子測(cè)序分析

對(duì)原代培養(yǎng)的GIST細(xì)胞進(jìn)行總RNA的提取，并對(duì)c-kit和PDGFRα基因的8個(gè)外顯子進(jìn)行核酸擴(kuò)增和正向、反向測(cè)序比對(duì)，見圖2。得到的序列與NCBI中Blast庫的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)c-kit基因11號(hào)外顯子發(fā)生點(diǎn)突變，胸腺嘧啶突變?yōu)橄汆堰剩瑸殡s合性突變。此點(diǎn)突變致使GIST細(xì)胞11號(hào)外顯子的第559位氨基酸由由纈氨酸（GTT）突變?yōu)樘於彼幔℅AT），導(dǎo)致了GIST的發(fā)生，見圖3。其余外顯子無突變。本研究中，原代培養(yǎng)的GIST細(xì)胞已經(jīng)傳30余代，在傳至30代時(shí)進(jìn)行以上測(cè)序，未發(fā)現(xiàn)二次突變。

圖2 c-kit基因11號(hào)外顯子發(fā)生點(diǎn)突變Fig.2 Point mutation in exon 11 of the c-kit gene

圖3 第559位點(diǎn)纈氨酸突變?yōu)樘於彼酕ig.3 Mutation of valine to aspartic acid at site 559

2.3 藥物敏感性結(jié)果

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，伊馬替尼單獨(dú)作用于GIST細(xì)胞24 h時(shí)，7.81 μmol/L濃度組與對(duì)照組比較，細(xì)胞抑制率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖4A）。舒尼替尼單獨(dú)作用于GIST細(xì)胞24 h時(shí)，15.63 μmol/L濃度組與對(duì)照組比較，細(xì)胞抑制率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖4B）。2種藥物對(duì)GIST細(xì)胞的作用均呈時(shí)間與濃度依賴性。聯(lián)合用藥組為等濃度聯(lián)合作用，抑制效果更顯著（圖4C）。

圖4 伊馬替尼和舒尼替尼單獨(dú)和聯(lián)合作用于GIST細(xì)胞時(shí)細(xì)胞增殖率的變化Fig.4 Changes in proliferation rate of GIST cells treated with imatinib and sunitinib alone or in combination

藥物作用48 h時(shí)，伊馬替尼組的IC50值為34.23±0.37，舒尼替尼組為28.85±0.52，同濃度聯(lián)合用藥組為11.97±0.18。CompuSyn是一款根據(jù)Chou-Talalay數(shù)學(xué)模型建立的應(yīng)用軟件，通過計(jì)算聯(lián)合指數(shù)（combination index，CI）分析兩藥聯(lián)合作用效果：CI＜1時(shí)，兩藥為協(xié)同作用效果；CI=1時(shí)，兩藥為疊加作用效果；CI＞1時(shí)，兩藥為拮抗作用效果。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)生長(zhǎng)抑制率Fa＜1時(shí)，大部分CI＜1，且Fa值越小CI值越小。當(dāng)Fa值介于0.1～0.7之間時(shí)，CI值介于0.90～0.98之間，說明兩藥聯(lián)合作用效果較好。因此，本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)單獨(dú)用藥組選擇31.25 μmol/L伊馬替尼和15.63 μmol/L舒尼替尼（此時(shí)兩藥抑制率均在80%左右），聯(lián)合用藥組選用同濃度藥物處理細(xì)胞，此濃度下聯(lián)合作用為協(xié)同作用。

2.4 楊氏模量測(cè)量結(jié)果

采用Icon 原子力顯微鏡和MLCT探針對(duì)GIST細(xì)胞測(cè)量楊氏模量（圖5），藥物作用48 h后，空白對(duì)照組楊氏模量為（8.26±1.06）kPa，伊馬替尼組為（4.90±0.54）kPa，舒尼替尼組為（5.51±0.79）kPa，聯(lián)合用藥組為（2.66±1.08）kPa。高斯擬合結(jié)果（圖6）顯示，伊馬替尼和舒尼替尼均可引起細(xì)胞楊氏模量減小，聯(lián)合用藥效果更顯著（P＜ 0.01）。

圖5 MLCT針尖圖像和探針測(cè)量細(xì)胞楊氏模量Fig.5 Image of MLCT tip and measurement of Young's modulus by probe

圖6 GIST細(xì)胞楊氏模量高斯擬合函數(shù)分布Fig.6 Gaussian fitting function distribution of Young’s modulus of gastrointestinal stromal tumor cells

3 討論

GIST的發(fā)生、發(fā)展由多種腫瘤相關(guān)分子突變所致，目前認(rèn)為c-kit或PDGFRα受體酪氨酸激酶的組成型激活突變是致癌的起始事件。突變的受體蛋白在不依賴配體的情況下持續(xù)自我激活，引起下游信號(hào)通路蛋白增多，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和分化、腫瘤形成。

伊馬替尼作為酪氨酸激酶抑制劑，最初被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于治療慢性粒細(xì)胞白血病，之后被批準(zhǔn)作為轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性GIST的一線藥物。然而，大多數(shù)患者會(huì)在2年內(nèi)出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥［9］。研究［10］顯示，在具有GIST 11號(hào)外顯子密碼子557～558突變的患者中，伊馬替尼治療后患者也存在生存時(shí)間減少的趨勢(shì)。因此，迫切需要能夠與伊馬替尼聯(lián)合應(yīng)用的凋亡誘導(dǎo)劑。而舒尼替尼既可抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體和轉(zhuǎn)染過程中的重排，又可以阻斷腫瘤生長(zhǎng)所需的血液和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給，有可能解決GIST患者的伊馬替尼耐藥性問題。

本研究成功培養(yǎng)c-kit基因11號(hào)外顯子發(fā)生點(diǎn)突變的GIST細(xì)胞，V559D為GIST細(xì)胞突變的熱點(diǎn)。為研究舒尼替尼對(duì)伊馬替尼處理GIST細(xì)胞的增效作用，本研究采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩藥單獨(dú)和聯(lián)合用藥對(duì)GIST細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果顯示，2種藥物對(duì)原代培養(yǎng)的V559D突變的GIST細(xì)胞均有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，呈時(shí)間與劑量依賴性，且聯(lián)合用藥的抑制效果大于單獨(dú)用藥（P＜ 0.05）。

從生物學(xué)角度分析，細(xì)胞對(duì)外界刺激的機(jī)械反應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)部的生物力學(xué)反應(yīng)，對(duì)保持細(xì)胞的生物活性具有重要意義。細(xì)胞通過改變自身行為和重塑微環(huán)境，動(dòng)態(tài)適應(yīng)機(jī)械因素的刺激，這種動(dòng)態(tài)適應(yīng)的結(jié)果不僅對(duì)胚胎發(fā)育和成人生理具有決定性作用，還與許多疾病密切相關(guān)。如在癌癥形成過程中，為了促進(jìn)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的微血管生成和建立，癌細(xì)胞楊氏模量和黏附力逐漸降低。同樣，侵襲性細(xì)胞通常楊氏模量和黏附性更低，但在不同器官和來源于不同器官的癌細(xì)胞中可能有不同的結(jié)論。這種機(jī)械特性的變化可能是由肌動(dòng)蛋白絲引起的，肌動(dòng)蛋白骨架的溶解導(dǎo)致楊氏模量顯著降低［11］。因此，機(jī)械特性近來被認(rèn)為是一種新的生物標(biāo)志物，而細(xì)胞表面機(jī)械特性研究另外一個(gè)最大的優(yōu)勢(shì)，在于能夠在保證細(xì)胞存活的擬生理?xiàng)l件下，對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而得到大量有效仿真的生物學(xué)數(shù)據(jù)。

有研究［12］指出，伊馬替尼通過降低鞘氨醇-1-磷酸進(jìn)而引起肺癌細(xì)胞骨架蛋白重新分布，并同時(shí)降低了細(xì)胞的楊氏模量。LEE等［12］發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-α刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，機(jī)械剛度增加了50%。KUNG等［13］則指出，順鉑處理的黑色素瘤細(xì)胞可以增強(qiáng)細(xì)胞骨架的機(jī)械拉伸，還可促進(jìn)細(xì)胞骨架的重排，導(dǎo)致細(xì)胞楊氏模量降低43%。CAI等［14］采用不同濃度的青蒿琥酯作用細(xì)胞24 h后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的楊氏模量下降了近三分之一。WANG等［15］指出，與對(duì)照樣品相比，經(jīng)佛波酯處理的K562細(xì)胞的彈性模量增加了近3倍。因此，本研究采用納米壓痕技術(shù)，在擬生理狀態(tài)下，對(duì)GIST細(xì)胞表面機(jī)械特性的變化進(jìn)行檢測(cè)，從而探討藥物產(chǎn)生的作用。通過檢測(cè)伊馬替尼、舒尼替尼及二者聯(lián)合用藥處理前后GIST細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度的變化，通過軟件測(cè)量分析發(fā)現(xiàn)藥物處理后GIST細(xì)胞楊氏模量降低，聯(lián)合用藥效果更明顯。原子力顯微鏡的納米力學(xué)檢測(cè)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)在近生理?xiàng)l件下測(cè)定癌細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度變化，為藥物研發(fā)早期評(píng)估抗癌藥物作用效率方面提供依據(jù)。

綜上所述，伊馬替尼和舒尼替尼對(duì)GIST細(xì)胞有增殖抑制作用，呈作用時(shí)間與劑量依賴性，聯(lián)合用藥時(shí)表現(xiàn)為協(xié)同作用。本研究基于納米壓痕技術(shù)發(fā)現(xiàn)，伊馬替尼和舒尼替尼均降低了GIST細(xì)胞的楊氏模量，聯(lián)合用藥時(shí)機(jī)械性能改變更明顯。