中國東北地區人乳頭瘤病毒31基因多態性分析

于淼，吳思，王爽，崔暢婉，路一平，孫崢嶸

（中國醫科大學附屬盛京醫院生物樣本庫，沈陽 110004）

宮頸癌是全球女性中常見的惡性腫瘤，人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持續性感染在宮頸癌的發生、發展中發揮關鍵作用［1］。目前可鑒定出的HPV類型高達200多種，根據其致癌潛力將HPV分為高危型HPV和低危型HPV。HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52和HPV58是全世界范圍內最常見的高危型HPV。2018年2月至2019年3月間，在中國醫科大學附屬盛京醫院接受HPV檢測的患者中，HPV31陽性率約為1.146%。

E6和E7基因編碼的早期蛋白是目前高危型HPV研究中最多的癌蛋白。它們是參與人類上皮細胞永生化和轉化的關鍵癌蛋白，并通過與多種宿主蛋白相互作用而發揮作用［2］。因此，存在于E6和E7基因上的突變很可能導致氨基酸序列突變，進而改變蛋白質的結構和功能，從而影響宿主的免疫應答情況［3-4］。CHAGAS等［5］對巴西東北部HPV31 E6和E7基因多態性進行研究，發現非同義突變C285T、A297G、A475G、C520T、C626T、G695A、A743G、C737G可以導致極性、親水性電位和氨基酸側鏈發生變化，進而可能改變癌蛋白折疊，從而影響病毒的致病性。ZHANG等［6］對四川地區HPV31 E6和E7基因多態性進行研究，也驗證了這些非同義突變的存在。但是，有關中國東北地區HPV31 E6和E7基因多態性的研究較少。因此，本研究對中國東北地區HPV31 E6和E7基因多態性進行了相關研究。

1 材料與方法

1.1 標本采集

收集2018年2月至2019年3月在中國醫科大學附屬盛京醫院進行HPV檢測、結果呈HPV31陽性的脫落宮頸細胞DNA標本。共采集到合格DNA標本204例，來源患者年齡為18～69歲，中位年齡41歲。標本采集前已取得患者知情同意，本研究承諾保護患者隱私。

1.2 PCR擴增

1.2.1 引物設計：應用Primer 5.0生物信息學軟件，以J04353.1為參考序列設計巢氏PCR引物。引物1，正義5’-TAAACTGCCAAGGTTGTG-3’，反義5’-TGTT CCTCCGCTTCCTGT-3’；引物2，正義5’-AAAAGTAG GGAGTGACCG-3’，反義5’-TTCGTCCTCTGAAATG TTG-3’。

1.2.2 擴增體系：巢氏PCR第一步擴增體系25 μL（DNA樣品3.0 μL，GoTaq? Green Master Mix，2×，12.5 μL，引物F1和R1各1.0 μL，無核酸酶水7.5 μL）；第二步擴增體系50 μL（第一步25 μL體系所得擴增產物2.0 μL，GoTaq? Green Master Mix，2×，25 μL，引物F2和R2各2.0 μL，無核酸酶水19.0 μL）。

1.2.3 擴增條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 1 min 30 s，重復30個循環，最后72 ℃延伸 10 min。

1.3 擴增產物測序

將擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將合格產物送至美國Invitrogen公司北京分公司測序。

1.4 序列比對和系統發育樹的構建

應用MegaX軟件將測序得到的結果與參考序列J04353.1進行序列比對分析，找出突變位點。將比對結果使用MegaX軟件中的Neighbor-Joining法構建系統發育樹。為確保實驗數據準確性，PCR擴增和序列分析至少重復2次。

1.5 選擇壓力分析

應用生物信息學軟件包PAML4.9中的codeml程序估測HPV31 E6和E7序列中的陽性選擇位點。該程序使用NEI等［7］的方法執行似然比測試，以推斷編碼區的非同義和同義核苷酸差異。HPV31 E6和E7蛋白序列應用MegaX進行比對。

1.6 蛋白質二級結構預測

應用PSIPred server（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預測參考序列的二級結構，隨后對突變位點所在的二級結構進行判斷。

1.7 表位預測

應用ProPred-Ⅰserver（http：//www.imtech.res.in/raghava/propred1/）［8］，在默認設置下預測人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）Ⅰ類結合表位。應 用ProPred server（http：//www.imtech.res.in/raghava/propred/）［9］，在默認設置下預測HLAⅡ類結合表位。應用ABCpred server（http：//www.imtech.res.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html），在默認參數下預測HPV31 E6和E7基因的B細胞表位［10］。

2 結果

2.1 HPV31 E6和E7基因突變

204例標本中，成功擴增并測序151例，剩余53例因拷貝數低或DNA提取液純度低等原因導致測序失敗。與HPV31 E6參考序列比對，16株（10.60%）病毒株與參考序列完全相同，135株（89.40%）存在基因多態性。共發現25個（5.56%）單核苷酸突變位點，其中14個為同義突變，11個為非同義突變。全部病毒株根據突變情況可分為20個種類，命名為HPV31 E601～HPV31 E620，其中HPV31 E601與參考序列完全相同。HPV31 E6基因中的所有突變見表1、表2。在151個HPV31 E7病毒株中共發現8個（2.69%）單核苷酸突變位點，其中3個是同義突變，5個是非同義突變。所有病毒株與參考序列相比均存在核苷酸突變，未發現與參考序列完全相同的病毒株。全部病毒株根據突變情況可分為8個種類，命名為HPV31 E701～HPV31 E708。HPV31 E7基因中的所有突變見表3。在HPV31 E6和E7中未觀察到移碼突變或是導致終止密碼子提前的突變，并且發現E7基因較E6基因更為保守。

表1 HPV31 E6核苷酸突變（核苷酸位點1～215）Tab.1 Nucleotide mutations of HPV31 E6（nucleotide position 1-215）

表2 HPV31 E6核苷酸突變（核苷酸位點216～450）Tab.2 Nucleotide mutations of HPV31 E6（nucleotide position 216-450）

表3 HPV31 E7核苷酸突變（核苷酸位點1～297）Tab.3 Nucleotide mutations of HPV 31 E7（nucleotide position 1-297）

（續表）

2.2 系統發育分析

在全部的151例HPV31 E6序列中，A系出現頻率最高（74例，49.01%），其次是C系（62例，41.06%），B系最低（15例，9.93%），見圖1A。在151個HPV31 E7序列中，同樣是A系出現頻率最高（74例，49.01%），其次是C系（71例，47.02%），B系最低（6例，3.97%），見圖1B。

圖1 HPV31 E6和HPV31 E7系統發育樹Fig.1 Neighbor-joining tree for HPV31 E6 and E7

2.3 選擇壓力分析

使用PAML4.9軟件中的codeml程序推測所得突變是否為陽性選擇位點，但在本研究所得突變中并未發現陽性選擇位點。

2.4 蛋白質二級結構預測

HPV31 E6中共11個非同義突變，其中7個發生在無規則卷曲結構，3個發生在線性結構，1個發生在α螺旋結構。HPV31 E6和E7蛋白質二級結構見圖2。序列中非同義突變位點所在二級結構見表1～3。

圖2 HPV31 E6和HPV31 E7蛋白質二級結構Fig.2 Protein secondary structure of HPV31 E6 and E7

2.5 表位預測

HPV31 E6中預測到MHCⅠ類表位9個，MHCⅡ類表位7個，B細胞表位5個。大部分HPV31 E6中的非同義突變存在于預測表位中（圖3A）。HPV31 E7中預測到MHCⅠ類表位4個，MHCⅡ類表位5個，B細胞表位2個。大部分HPV31 E7中的非同義突變存在于預測表位中（圖3B）。

圖3 HPV31 E6和HPV31 E7表位預測Fig.3 Predicted MHC and B-cell epitopes of HPV31 E6 and E7 proteins

3 討論

持續感染高危型HPV是宮頸癌發生、發展的關鍵。E6和E7基因編碼的早期蛋白是目前高危型HPV中研究最多的關鍵致癌蛋白。已有大量研究證實，HPV16和HPV18 E6和E7基因多態性在病毒的生物學功能和臨床疾病進展中具有重要意義。HPV31作為較高流行類型，有研究［11］表明其可使宮頸上皮高級別病變的風險顯著增加。本研究對中國東北地區HPV31 E6和E7 基因多態性分布進行了研究。

本研究中，E7的突變頻率較E6低，即與E6基因相比E7基因更為保守。在HPV31 E6基因中，A213T是最常見的同義突變，C413T（A138V）是最常見的非同義突變。在HPV31 E7基因中，C111T是最常見的同義突變，A184G（K62E）是最常見的非同義突變。有研究［12-13］表明，HPV的型內突變可使疫苗的保護作用降低，改變病毒的致病能力，使病毒逃逸風險和致癌風險增加。當選擇E6、E7作為引物設計或診斷檢測以及疫苗設計的靶標時，有必要將這些突變位點考慮在內。本研究中，發生在不同蛋白質二級結構中的非同義突變很可能使蛋白質極性、親水性電位和氨基酸側鏈發生變化，從而可能改變癌蛋白折疊［13］，進而使蛋白質功能發生改變。因此，非同義突變可能會通過改變E6和E7癌蛋白的結構來影響病毒的致癌潛力、與宿主細胞的相互作用以及疫苗效果。

研究［14］報道HPV31 A譜系為美國女性中最廣泛流行的譜系（41.7%），其次是C譜系（37.2%），B譜系最低（21.1%）。而在意大利，C譜系（65.8%）最為流行，其次是B譜系（29.3%），A譜系（4.9%）流行程度最低［15］。本研究證實中國東北地區的分布情況與美國大致相同，與意大利存在差異，表明HPV31 E6和E7基因多態性的分布情況與地域和種族有一定相關性。

MHCⅠ/Ⅱ類表位和B細胞表位在疫苗設計和診斷方法的研究中具有重要意義。本研究在E6基因中預測到MHCⅠ類表位9個，MHCⅡ類表位7個，B細胞表位5個。非同義突變A11C（N4T）、T331C（C111R）和A154C（I52L）存在于MHCⅠ類表位，C178T（H60Y）、C430T（R144C）、A439G（T147A）同時存在于MHCⅡ類表位和B細胞表位，A190G（T64A）、T383C（I128T）、A409G（I137V）、C413T（A138V）存在于B細胞表位。在E7基因中預測到MHCⅠ類表位4個，MHCⅡ類表位5個，B細胞表位2個。非同義突變A29G（D10G）、C149A（S50Y）存在于MHCⅠ類表位，G136A（E46K）同時存在于MHCⅠ類表位和B細胞表位。這些突變均可能使表位發生改變，從而使表位的結合能力發生變化，影響其與宿主細胞的免疫作用。

綜上所述，HPV31 E6和E7基因在中國東北地區呈基因多態性分布，本研究結果為更深入了解基因多態性的地理分布情況以及基因探針、疫苗和治療方案的設計提供了理論依據。