增食欲素A調節大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞自噬的研究

常曉岑，溫晶，索琳娜，白博文，郭丹，趙玉巖

（中國醫科大學 1.附屬第四醫院內分泌代謝內科，沈陽 110032；2.附屬第一醫院內分泌與代謝病科，內分泌研究所，遼寧省內分泌疾病重點實驗室，沈陽 110001）

增食欲素是下丘腦的神經肽，包括增食欲素A（orexin-A）和增食欲素B（orexin-B）2種，在調節睡眠、覺醒、神經內分泌平衡、攝食、應激反應等行為中起十分重要的作用［1-4］。增食欲素有2種膜結合G蛋白耦聯受體，即增食欲素受體1（orexin receptor-1，OX1R）和增食欲素受體2（orexin receptor-2，OX2R）。orexin-A是OX1R的高親和力受體激動劑，相比之下，orexin-A對OX2R親和力較低［5-7］。研究［8］表明，orexin-A比orexin-B的生物學作用更廣泛且重要。既往研究與本課題組前期研究［9-11］均發現增食欲素對多種內分泌腺細胞增殖、凋亡、細胞活力有影響，但對自噬的作用鮮有研究。因此，本研究擬分析orexin-A對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞自噬的作用，即對LC3Ⅰ、LC3Ⅱ以及Beclin-1蛋白表達水平的影響，以及orexin-A調節PC12細胞自噬后對去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）分泌水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

DMEM培養基和10%胎牛血清購自德國默克Sigma-Aldrich公司；胰蛋白酶購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，ELISA 試劑盒購自武漢云克隆公司；戊二醛固定液購自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗LC3多克隆抗體購自中國ABclonal公司；兔抗Beclin-1抗體購自英國Abcam公司；OX1R抑制劑SB334867購自美國Cell signalling公司；自噬抑制劑3-MA試劑盒購自美國Sigma公司；BCA 蛋白定量試劑盒、Western blotting一抗和二抗稀釋液均購于自碧云天生物技術研究所；GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗等均購自艾博抗（上海）貿易有限公司；其余試劑均為國產分析純。

低溫高速離心機（3K-15）購自德國Sigma公司；化學發光儀（4200SF）購自中國天能儀器公司；酶標儀購自奧地利安托斯儀器公司；低速離心機購自科大創新股份有限公司中佳分公司；電熱恒溫干燥箱購自北京市光明醫療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組：將PC12細胞接種在DMEM高糖培養基+10%胎牛血清+1%雙抗（100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素）培養基中，于37 ℃、100%濕度、5%CO2的恒溫培養箱中培養，每1～2 d換液1次。待細胞處于對數生長期時，取出培養皿，將細胞接種于24孔板中（2 mL/孔）。既往研究［12］發現，10-6mol/L orexin-A刺激腎上腺髓質分泌腎上腺素及NE顯著，因此，本研究采用10-6mol/L orexin-A進行實驗。細胞培養24 h后，分為3組進行實驗，即orexin-A組（加 入10-6mol/L orexin-A），orexin-A+OX1Ri組（SB334867預處理1 h后加入10-6mol/L orexin-A）和空白對照組，每組設3個復孔，每組處理時間為24 h。

1.2.2 透射電鏡觀察：棄掉空白對照組和orexin-A組培養基，用PBS洗滌3次后，將PC12細胞移入新的離心管中，3 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL 2.5%戊二醛固定24 h，透射電鏡下觀察并拍照。

1.2.3 Western blotting：收集各組處于對數生長期的PC12細胞，加入裂解液冰上充分裂解，BCA法測定蛋白濃度。調整蛋白濃度后，進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，洗膜3次后轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。加入一抗，4 ℃孵育過夜。洗膜3次后加入二抗，室溫孵育2 h，洗膜3次，ECL顯色。應用Image J軟件分析結果。

1.2.4 ELISA檢測上清液中NE含量：將細胞培養液從培養瓶移入離心管中，離心后棄沉淀，取上清液。按照ELISA試劑盒說明書檢測上清液中NE含量。每個樣品測定3次，用酶標儀檢測OD值，計算每個樣品的平均OD值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Orexin-A上調PC12細胞OX1R蛋白表達

如圖1所示，orexin-A顯著上調了PC12細胞中OX1R蛋白的表達水平（P＜ 0.05），而同時加入orexin-A和OX1R抑制劑的PC12細胞中OX1R蛋白的表達水平明顯下降，且與空白對照組比較無統計學差異（P＞0.05）。

圖1 Orexin-A對PC12細胞OX1R蛋白表達的影響Fig.1 The effect of orexin-A on OX1R protein expression in PC12 cells

2.2 Orexin-A對PC12細胞自噬的影響

如圖2所示，透射電鏡下可見，空白對照組正常PC12細胞的細胞質結構致密，各細胞器清晰，形態良好，少見自噬的發生。而orexin-A組PC12細胞則較空白對照組自噬體增多。表明orexin-A促進了PC12細胞自噬。

圖2 透射電鏡觀察orexin-A對PC12細胞自噬的影響Fig.2 The effect of orexin-A on autophagy in PC12 cells observed by transmission electron microscope

2.3 Orexin-A通過OX1R促進PC12細胞自噬

如 圖3、4所 示，orexin-A組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表達水平均顯著高于空白對照組，而orexin-A+OX1Ri組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表達水平則顯著低于orexin-A組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。orexin-A組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著高于空白對照組和orexin-A+OX1Ri組。

圖3 Orexin-A對PC12細胞LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白表達的影響Fig.3 The effect of orexin-A on LC3Ⅱ and LC3Ⅰ protein expression in PC12 cells

2.4 Orexin-A對PC12中NE分泌的調節

結果顯示，orexin-A組NE濃度［（1.99±0.14）pg/mL］顯著高于空白對照組［（1.77±0.10）pg/mL］，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；而orexin-A+OX1Ri組的NE濃度［（1.88±0.13）pg/mL］顯著低于orexin-A組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。提示orexin-A可能是通過OX1R上調PC12細胞NE分泌水平。

3 討論

orexin-A和orexin-B是來自同一前體前orexin 原的神經肽。二者高度表達于涉及攝食行為的側下丘腦區域，也存在于腎上腺、胃腸道、胰腺等外周組織及血液中。增食欲素的2個功能性受體（OX1R、OX2R）廣泛且有差異地分布于腦組織中，也見于腎臟、腎上腺、甲狀腺、睪丸、卵巢、空腸、肺等外周組織中。研究［5-6，13-14］表明，orexin-A與OX1R的結合力是orexin-B與OX1R結合力的5～100倍，而orexin-A和orexin-B對于OX2R則具有相似的親和力。相對于orexin-B，orexin-A穩定性好、生物學作用更強且廣泛，而orexin-A又是OX1R的高親和力受體激動劑，因此，本研究主要探討orexin-A與OX1R的作用。結果顯示，orexin-A組PC12細胞中OX1R的蛋白表達水平顯著高于空白對照組，而加入受體抑制劑后，PC12細胞OX1R的蛋白表達水平顯著下降（P＜ 0.05），提示orexin-A上調了PC12細胞OX1R蛋白的表達。

圖4 Orexin-A對PC12細胞Beclin-1蛋白表達的影響Fig.4 Orexin-A effect of orexin-A on Beclin-1 protein expression in PC12 cells

增食欲素系統具有調節攝食與能量平衡，促進覺醒，以及調節呼吸、情緒、心率、血壓等作用［15］。近年來的研究主要關注于增食欲素對細胞增殖、凋亡、活力、激素分泌的作用，但對細胞自噬的影響鮮有研究。細胞自噬被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡，是依賴溶酶體降解細胞質內細胞器和大分子物質的代謝途徑［16］。自噬在細胞新陳代謝、結構重建、生長發育中起著重要作用。本研究發現，透射電鏡下可見orexin-A組PC12細胞的自噬體較空白對照組PC12細胞增多，提示orexin-A可能促進了細胞自噬。LC3是自噬標志物，有LC3Ⅰ和LC3Ⅱ 2種表現形式，自噬形成時，胞漿型LC3（即LC3Ⅰ）會酶解掉一小段多肽，轉變為活化形式的LC3（自噬體膜型），即LC3Ⅱ。研究［17-18］表明，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值與自噬體形成的數量成正比，因此，可用LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值估計自噬水平，比值增高往往代表自噬體形成。Beclin-1是酵母ATG6的同源體，也是自噬相關的特異性基因，調控自噬前體和自噬體的形成［19］。因此，也可用其表達水平判斷自噬水平，Beclin-1升高是自噬形成的重要指標［20］。本研究結果顯示，orexin-A組PC12細胞的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1的蛋白表達水平均顯著高于空白對照組和orexin-A+OX1Ri組（P＜ 0.05）。提示orexin-A可能通過OX1R來激活自噬相關蛋白LC3和Beclin-1，從而促進PC12細胞自噬，但其具體機制有待進一步研究。

本研究還發現，orexin-A組PC12細胞的NE含量顯著高于空白對照組，而加入OX1Ri組PC12細胞的NE含量明顯下降，說明orexin-A通過OX1R影響細胞自噬、調節PC12細胞的NE分泌水平，提示PC12細胞的NE分泌調節機制可能與細胞自噬有關。

綜上所述，本研究發現orexin-A可能通過OX1R促進PC12細胞自噬，并上調PC12細胞的NE分泌水平，且orexin-A對PC12細胞NE分泌水平的調節機制可能與細胞自噬有關。盡管具體的分子機制還需進一步探索，但本研究發現了orexin-A對腎上腺細胞自噬的促進作用，補充了orexin-A的生物學功能，對于進一步認識orexin-A具有重要意義。orexin-A及其受體OX1R可能成為調節腎上腺功能紊亂的治療靶點之一。