脂質(zhì)組學(xué)：中藥調(diào)脂效應(yīng)及其作用機(jī)制研究的有效途徑

蔡瑩，都曉輝，張愛(ài)華，王喜軍

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學(xué)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040)

健康模式及疾病譜的變化給現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究提出眾多新的命題，單靶點(diǎn)單一降脂藥物的簡(jiǎn)單治療模式難以解決脂代謝紊亂引發(fā)的多靶點(diǎn)復(fù)雜性疾病的治療問(wèn)題[1]。脂代謝異常可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，例如:動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、癌癥、非酒精性脂肪肝炎、肥胖及阿茲海默癥等[2-7]。血脂異常經(jīng)常出現(xiàn)在代謝綜合征和2型糖尿病病程中[8-9]，通常表現(xiàn)為總膽固醇、低密度脂蛋白，甘油三酯水平升高，高密度脂蛋白水平下降[10-11]。疾病脂質(zhì)異常代謝特征為其治療研究提供了新策略[12]。中藥復(fù)方制劑是由多種藥物按君臣佐使配伍規(guī)則組成的“有制之師”，針對(duì)疾病實(shí)施多成分、多靶點(diǎn)、多層次的整體作用，調(diào)脂療效明確，作用溫和，相比單獨(dú)的他汀類藥物治療，降脂干預(yù)風(fēng)險(xiǎn)更低，安全性更好，對(duì)疾病的預(yù)防與治療意義重大[13-15]。因此，以機(jī)體脂代謝為靶向特征的方劑與針對(duì)單一靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)的藥物相比，具有獨(dú)特的治療優(yōu)勢(shì)。但目前中藥調(diào)脂效應(yīng)研究還停留在幾個(gè)血脂指標(biāo)的簡(jiǎn)單重復(fù)，缺乏現(xiàn)代語(yǔ)言的科學(xué)闡釋，其療效靶點(diǎn)、作用機(jī)制不清晰、不明確，這極大地限制了中藥調(diào)脂的應(yīng)用及調(diào)脂作用有效性的科學(xué)闡釋[16]。

脂質(zhì)的重要生物功能及其與疾病的關(guān)系，催生了脂質(zhì)組學(xué)這一新的研究領(lǐng)域。脂質(zhì)組學(xué)采用分析化學(xué)方法對(duì)生物體脂質(zhì)組進(jìn)行有目的分析，可有效分析不同生理病理狀態(tài)下脂質(zhì)水平、脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)的變化，從而有效識(shí)別新的信號(hào)分子，揭示不同生理病理狀況的潛在機(jī)制，發(fā)現(xiàn)用于疾病早期診斷和預(yù)后的潛在脂質(zhì)生物標(biāo)志物，篩選藥物靶點(diǎn)及評(píng)價(jià)藥物功效，為疾病的防治開(kāi)辟新的思路[17]。脂代謝研究正在經(jīng)歷從分子水平向網(wǎng)絡(luò)互作集成、從靜態(tài)到動(dòng)態(tài)等方面的縱深發(fā)展，已經(jīng)在疾病早期診斷、藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)及疾病機(jī)理研究等方面取得重大進(jìn)展。因此，本文系統(tǒng)綜述脂質(zhì)組學(xué)分析的關(guān)鍵技術(shù)以及脂質(zhì)組學(xué)在生命科學(xué)研究中的最新進(jìn)展，為中藥調(diào)脂作用機(jī)制研究提供方法參考。

1 脂質(zhì)組學(xué)研究方法

研究不同生理病理狀態(tài)下的脂質(zhì)水平，可有效評(píng)估機(jī)體生理狀態(tài)，從脂質(zhì)分子層面闡釋進(jìn)行疾病機(jī)制的研究[18]。脂質(zhì)組學(xué)研究方法有以下優(yōu)勢(shì)：只研究脂類物質(zhì)及其代謝共同物，脂類物質(zhì)在結(jié)構(gòu)上的共同特點(diǎn)決定了樣品前處理及分析技術(shù)平臺(tái)的搭建較為容易，而且可以借鑒代謝組學(xué)的研究方法；脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和完善速度較快，并能建立與其他組學(xué)的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系；脂質(zhì)組學(xué)分析的技術(shù)平臺(tái)可用于代謝組學(xué)的研究，促進(jìn)代謝組學(xué)發(fā)展。

完整的脂質(zhì)組學(xué)研究流程主要包括脂質(zhì)的提取、分離，數(shù)據(jù)采集以及數(shù)據(jù)分析。根據(jù)分析目的不同又可分為靶向脂質(zhì)組學(xué)、非靶向脂質(zhì)組學(xué)以及將兩種分析策略相結(jié)合的擬靶向脂質(zhì)組學(xué)。由于脂質(zhì)不是以游離形式存在于基質(zhì)中，待分析的生物樣本通常需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)那疤幚硪越档蜆O性代謝物對(duì)脂質(zhì)分析的干擾。現(xiàn)有研究中多采用不同比例氯仿/甲醇溶液進(jìn)行液液萃取從而提取分離脂質(zhì)，即較為經(jīng)典的Folth萃取法、Bligh-Dyer萃取法等，適用于從各種樣品基質(zhì)中非選擇性和可重復(fù)地提取各種類別的脂質(zhì)[19-20]。

包括薄層色譜(TLC)、液相色譜(LC)、氣相色譜(GC)、親水相互作用(HILIC)等在內(nèi)的各種色譜儀具有強(qiáng)大的分離能力,可以對(duì)復(fù)雜樣品中的脂質(zhì)化合物進(jìn)行分離，現(xiàn)已成為全面脂質(zhì)分析必不可少的有效工具。色譜質(zhì)譜聯(lián)用法可以為脂質(zhì)輪廓分析提供更詳盡的信息。質(zhì)譜由于其出色的準(zhǔn)確度、靈敏度以及分析效率成為脂質(zhì)分析的有力工具[17,21]，質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展極大地推動(dòng)了脂質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。在脂質(zhì)組學(xué)的相關(guān)研究中，電噴霧電離(ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)已成為脂質(zhì)組織分析的主流電離方法[22]。此外，大氣壓化學(xué)電離(APCI)也常見(jiàn)于脂質(zhì)組學(xué)的研究中，可大幅提升檢測(cè)靈敏度[23]。基于質(zhì)譜的脂質(zhì)組學(xué)可以分為：樣品直接注入色譜儀的鳥槍脂質(zhì)組學(xué)，基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)的脂質(zhì)組學(xué)，基于離子遷移質(zhì)譜技術(shù)(IM-MS)的脂質(zhì)組學(xué)，質(zhì)譜成像(MSI)等。脂質(zhì)組學(xué)常用的儀器分析方法及應(yīng)用總結(jié)見(jiàn)表1。

表1 脂質(zhì)組學(xué)的儀器分析方法及應(yīng)用

此外，二維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，超臨界流體色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，拉曼光譜、核磁共振(NMR)光譜等儀器技術(shù)也廣泛應(yīng)用于脂質(zhì)分析[50-54]。多種儀器聯(lián)用進(jìn)行脂質(zhì)分析可顯著提高峰容量，適用于分離復(fù)雜樣品中的多種脂質(zhì)，能夠獲得全面的脂質(zhì)信息，在脂質(zhì)組學(xué)研究中具有較大的發(fā)展?jié)摿53,55]。

2 脂質(zhì)組學(xué)在中藥治療效應(yīng)中應(yīng)用

脂質(zhì)組學(xué)方法為中藥調(diào)脂研究提供了新的研究途徑，近年來(lái)，通過(guò)脂質(zhì)組學(xué)方法分析潛在作用機(jī)制的研究越來(lái)越多。大量的研究結(jié)果顯示，相比西藥降脂，中藥治療血脂異常具有良好的療效和安全性，中藥也逐漸成為探索開(kāi)發(fā)新藥的主要研究目標(biāo)載體[56]。

2.1 鳥槍脂質(zhì)組學(xué)方法

研究人員對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型給予人參皂苷compound K(CK)，通過(guò)鳥槍脂質(zhì)組學(xué)方法分析了小鼠血清脂質(zhì)代謝物。研究發(fā)現(xiàn)差異脂質(zhì)分別為甘油三酯(TG)、膽固醇酯(CE)、磷脂酰膽堿(PC)和溶血磷脂酰膽堿(LPC)，人參皂苷CK可顯著回調(diào)小鼠血清中LPC和CE的水平[57]。

2.2 LC-MS方法

2.2.1 非靶向LC-MS

非靶向液質(zhì)聯(lián)用脂質(zhì)組學(xué)方法可對(duì)樣品中的脂質(zhì)進(jìn)行全面的分析及描繪，獲得豐富的脂質(zhì)種類及脂質(zhì)代謝信息，可供構(gòu)建完整的脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)[58]。紅景天在中醫(yī)藥中具有悠久的使用歷史，研究人員為明確紅景天低聚原花青素(OPCRR)的作用，采用HPLC-ESI-MS對(duì)口服紅景天低聚原花青素的大鼠血清脂質(zhì)譜進(jìn)行非靶向分析，結(jié)果表明OPCRR治療顯著降低總膽固醇、總甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和ox-LDL等血脂譜，升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，可有效調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[59]。以高血脂為主要特征的高脂血癥可逐步發(fā)展成為動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病，嚴(yán)重影響人們的健康與生活質(zhì)量[60]。研究人員采用高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠模型，給予茯苓并使用UPLC-HDMS非靶向分析大鼠血漿樣品[61]。研究發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)茯苓治療組的大鼠血漿相比，茯苓治療組血漿中甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白(LDL)膽固醇濃度的顯著下降，證明茯苓可顯著改善高脂血癥和相關(guān)的脂質(zhì)代謝物異常。

2.2.2 靶向LC-MS

靶向脂質(zhì)組學(xué)分析憑借其高靈敏度和高特異性的特點(diǎn)，常用于關(guān)鍵脂質(zhì)代謝通路或靶標(biāo)脂質(zhì)的分析或驗(yàn)證。多反映監(jiān)測(cè)模式(MRM)最為常用，可以提高分析靈敏度、選擇性以及線性范圍[62]。已有研究表明，苦丁茶中的三萜皂苷類可有效預(yù)防高脂血癥，溶血甘油磷脂(Lyso-GPL)與高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等脂代謝異常類疾病有關(guān)。研究人員采用基于多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的靶向分析策略對(duì)小鼠血清中Lyso-GPL進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析[63]。該實(shí)驗(yàn)在小鼠血清中共鑒定出6類153種Lyso-GPL異構(gòu)體，與對(duì)照組相比，高脂血癥小鼠血清內(nèi)總Lyso-GPLs含量減少，并且給予苦丁茶中的三萜皂苷類可回調(diào)血清中總Lyso-GPLs的含量。澤瀉具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)的藥理作用，通常用于治療高脂血癥。而溶血磷脂酰膽堿(Lyso PC)在脂質(zhì)代謝紊亂中起關(guān)鍵作用。因此，研究人員通過(guò)UHPLC-QTRAP-MS/MS定量分析高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥小鼠模型中Lyso PC的變化，以評(píng)估澤瀉三萜類提取物的降脂活性[64]。研究表明澤瀉提取物中的三萜可以下調(diào)小鼠血清中27個(gè)Lyso PCs，上調(diào)19個(gè)Lyso PCs,Lyso PCs的代謝變化有助于對(duì)澤瀉降脂作用潛在機(jī)制的解讀。

3 脂質(zhì)組學(xué)在中藥調(diào)脂作用機(jī)制研究實(shí)踐

采用脂質(zhì)組學(xué)方法獲得的數(shù)據(jù)拓展了我們對(duì)脂代謝紊亂疾病生理病理學(xué)的認(rèn)識(shí)，許多研究證實(shí)，不同的脂質(zhì)異常代謝通過(guò)不同的途徑發(fā)揮特定的致病作用。脂質(zhì)組學(xué)研究方法有效展現(xiàn)了中藥多靶點(diǎn)多途徑調(diào)節(jié)脂代謝紊亂的治療特點(diǎn)，可通過(guò)探索新的治療靶點(diǎn)為我們提供全新的中藥調(diào)脂策略[65]。

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是由于肝臟中脂肪過(guò)度積累[66]引起的慢性肝病之一，大量研究表明，NAFLD與肥胖，高血脂等代謝綜合征密切相關(guān)[67]。DENG等[68]采用基于超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)的非靶向脂質(zhì)組學(xué)方法，分析參苓白術(shù)散對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠模型的保護(hù)作用機(jī)制。非靶向脂質(zhì)組學(xué)方法分析大鼠肝脂質(zhì)的結(jié)果表明，參苓白術(shù)散對(duì)NAFLD大鼠模型的30種脂質(zhì)均有回調(diào)作用。代謝通路分析結(jié)果表明，參苓白術(shù)散通過(guò)干預(yù)甘油磷脂代謝及甘油酯代謝途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)脂質(zhì)作用。二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，由陳皮、姜半夏、茯苓、炙甘草組成。有研究表明二陳湯對(duì)肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等脂代謝紊亂相關(guān)疾病有一定的治療效果[69-70]。研究人員采用高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)C57BL/6 J小鼠，采用UPLC-Q-TOF MS對(duì)小鼠血漿進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析、多變量分析和脂質(zhì)通路富集分析[71]。研究結(jié)果表明，二陳湯顯著改變小鼠體內(nèi)神經(jīng)酰胺和甘油三酯代謝水平，并通過(guò)神經(jīng)酰胺和甘油三酯代謝通路發(fā)揮脂質(zhì)調(diào)節(jié)作用。中藥復(fù)方開(kāi)心散由遠(yuǎn)志、人參、茯苓和石菖蒲4味中藥組成,具有防治阿爾茲海默病的功效。研究人員利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)小鼠血清提取物進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)阿爾茲海默病模型組小鼠血清中的亞油酸、花生四烯酸和鞘脂代謝途徑發(fā)生紊亂,而開(kāi)心散能夠回調(diào)這些通路從而緩解阿爾茲海默病模型小鼠的癥狀[72]。

4 展望

體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂可引發(fā)多種疾病，通過(guò)脂質(zhì)組學(xué)手段可以快速找到差異脂質(zhì)代謝物，但目前的中藥調(diào)脂研究中，脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用大多局限于鑒定脂質(zhì)的種類和結(jié)構(gòu)，對(duì)潛在的作用機(jī)制還缺乏深入的挖掘和解讀。質(zhì)譜成像技術(shù)等新興的脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)可從空間等多個(gè)維度探尋中藥藥效作用的靶點(diǎn)，豐富對(duì)高脂血癥的病理學(xué)認(rèn)識(shí)，還可以深入中藥調(diào)脂機(jī)制的闡釋，在中藥調(diào)脂機(jī)制的研究中具有廣闊的應(yīng)用空間。

目前，中藥調(diào)脂研究中，對(duì)生物體內(nèi)脂質(zhì)組的研究多為非靶向的廣譜脂質(zhì)檢測(cè)，靶向檢測(cè)特定脂質(zhì)的研究較少。擬靶向脂質(zhì)組學(xué)策略結(jié)合了靶向分析策略和非靶向分析策略的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)高分辨質(zhì)譜綜合可獲取脂質(zhì)代謝物的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜信息，再?gòu)亩?jí)質(zhì)譜中選擇特征脂質(zhì)離子對(duì)，然后以MRM模式在串聯(lián)質(zhì)譜儀器上進(jìn)行離子對(duì)采集。擬靶向分析策略在中藥調(diào)脂中的應(yīng)用有希望提高分析結(jié)果的覆蓋率，發(fā)現(xiàn)更多的潛在脂質(zhì)標(biāo)記物，獲取更準(zhǔn)確的定量分析結(jié)果。針對(duì)脂質(zhì)分離困難的問(wèn)題，可用離子遷移質(zhì)譜增強(qiáng)復(fù)合脂質(zhì)的分離效果，增強(qiáng)同分異構(gòu)體的分離程度，從而增強(qiáng)脂質(zhì)的鑒定能力及脂質(zhì)分析的準(zhǔn)確性。

脂質(zhì)的鑒定和量化對(duì)深入了解脂質(zhì)在疾病發(fā)展中的功能具有重要意義。借助脂質(zhì)組學(xué)方法，采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等脂質(zhì)組學(xué)方法可以在相對(duì)較短的分析時(shí)間內(nèi)從總脂質(zhì)提取物中直接鑒定和準(zhǔn)確定量數(shù)百種脂質(zhì)，有利于對(duì)中藥降脂作用機(jī)制進(jìn)行闡釋，也可為中醫(yī)藥現(xiàn)代化提供全新的見(jiàn)解。