蜂針蜇刺療法的鎮痛抗炎作用及對類風濕大鼠脾臟組織切片的改變

倪珊，劉彥含，王瑛，楊萌萌

(黑龍江省森工總醫院，黑龍江 哈爾濱 150000)

蜂針蜇刺治療簡稱蜂療，是以鑷子夾持蜜蜂，利用蜜蜂蜂針為工具，在中醫針灸理論的指導下，循經絡皮部和穴位施行不同手法的針刺，將蜂毒的藥理作用與穴位的治療作用相結以防治疾病的方法稱為蜂針療法[1]。《黃帝內經》記載：“蜂螯有毒可療疾”，在方以智《物理小識》卷五中，記述將蜂針制作“藥蜂針”的方法：“取黃蜂之尾針合硫煉，加水麝為藥。置瘡湯頭，以火點而灸之。”蜂毒最早收錄于《吉林中草藥》：“蜂毒，祛風濕，治風濕性關節炎。”近年來，隨著中醫學的不斷發展和政策的支持，不斷有臨床醫師在臨床上應用蜂療來治療類風濕性關節炎[2-5]。本研究以動物實驗為基礎，進一步闡述蜂療對類風濕性關節炎的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

昆明小鼠，SPF級，周齡7周左右，體質量18～20 g，購自于黑龍江中醫藥大學動物實驗中心，動物使用許可證號：SCXK(黑)2018-003，飼養環境溫濕度：室溫18～22 ℃，相對濕度為50%～60%，適應性喂養1周。

SD大鼠，SPF級，周齡8周左右，體質量200～220 g，購自于黑龍江中醫藥大學動物實驗中心，動物使用許可證號：SCXK(黑)2018-003，飼養環境溫濕度：室溫18～22℃，相對濕度為50%～60%，適應性喂養1周。

1.2 主要儀器及試劑

弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑(Sigma公司，批號：SLBQ2284V、SLBK1731V)；牛Ⅱ型膠原液(Chondrex公司，批號：190514)；醋酸(阿拉丁試劑上海有限公司)；二甲苯(阿拉丁試劑上海有限公司)；無水乙醇(中國國藥)；蘇木精(中國Solarbio)；曙紅Y-醇溶(中國sangon)；洛索洛芬鈉(第一三共制藥上海有限公司，批號：20191201)；分析天平；石蠟切片機(德國Leica)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏)；超純水系統(香港Heal Force)；顯微鏡型號(日本OLUMPUS)；顯微鏡拍照系統(日本OLUMPUS)，MIKRO 200R離心機(德國Hettich公司)。

1.3 實驗分組及給藥

1.3.1 鎮痛實驗

醋酸致小鼠扭體實驗:雄性小鼠50只。禁食不禁水過夜。隨機分為5組(每組10只)：蜂針蜇刺30 s組、蜂針蜇刺1 min組、蜂針蜇刺5 min組、陽性對照藥組(洛索洛芬鈉組，0.025 g/kg)和空白組(等體積溶劑)。給藥30 min后，0.8%的醋酸生理鹽水溶液，沿腹膜壁緩慢注入腹腔。記錄20 min內，小鼠扭體次數。

1.3.2 抗炎實驗

二甲苯致耳腫脹實驗:小鼠50只，雌雄各半。禁食不禁水過夜。隨機分為5組(每組雌雄各5只，共10只)：蜂針蜇刺30 s組、蜂針蜇刺1 min組、蜂針蜇刺5 min組、陽性對照藥組(洛索洛芬鈉組，0.025 g/kg)和空白組(等體積溶劑)。給藥30 min后，在小鼠右耳正反面涂抹二甲苯20 μL。2.5 h后，處死小鼠，8 mm打孔器，打下小鼠左右耳，分析天平稱取重量,計算左右耳重量差值。

1.3.3 類風濕實驗

雄性SD大鼠60只，按體質量隨機分為空白組、模型組、陽性對照藥組(洛索洛芬鈉組，0.009 g/kg)、蜂針(蜜蜂來源：意大利蜂，由黑龍江省森工總醫院蜂療室提供)治療組(5 min，1 min，30 s)，每組10只。二次免疫時開始治療，空白對照組和模型組大鼠灌胃給與等體積蒸餾水。蜂針治療組取足三里、血海、腎俞、肝俞、脾俞穴，以75%酒精消毒所取得穴位，用鑷子輕輕捏住蜜蜂的腰部，對其尾部對準穴位，讓其自然蟄入穴位并留針(30 s、1 min、5 min) 后，將毒刺拔除，每只活蜂只蟄1個穴位。蜂針治療每天1次，每次1針，每次治療取一個穴位，以上穴位輪流交替，共治療35 d。

1.4 造模方法

在冰水浴條件下，向含弗氏完全佐劑中離心管中緩慢滴加等體積的牛Ⅱ型膠原液(2 mg/mL)，用電動勻漿器勻漿制備成乳濁液(含膠原1 mg/mL)。造模大鼠在尾根基部3個不同部位皮內注射等體積的膠原乳濁液200 μL/只，進行初次免疫。6 d后，同樣方法注射弗氏不完全佐劑乳濁液，進行二次免疫，100 μL/只。二次免疫后，足部腫脹的大鼠即為類風濕(CIA)模型成功大鼠。

1.5 觀察指標及檢測方法

鎮痛實驗觀察小鼠扭體次數，計算扭體次數。抗炎實驗稱量小鼠左右耳重量，計算重量差。類風濕實驗，分別在治療15 d和35 d測量大鼠的足腫脹體積，治療35 d后，禁食不禁水8 h，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.7 mL/100 g)，麻醉后，取脾臟、胸腺稱重，稱重后的脾臟進行固定，將固定后的脾臟HE染色。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 各組小鼠扭體次數、耳腫脹重量差值比較

由表1可見，與空白組比較，蜂針蜇刺5 min、1 min、30 s、陽性對照藥組都對小鼠的扭體次數有顯著的抑制作用(P<0.01)。與空白組比較，蜂針蜇刺5 min、1 min、陽性對照藥組都對小鼠耳腫脹重量差值有抑制作用(P<0.05)。

表1 小鼠扭體次數、耳腫脹重量差值的比較

2.2 各組大鼠的足腫脹體積、足厚度、足周長比較

由表2可見，與模型組比較，在造模前1天，各治療組和空白組的都沒有差異；與模型組比較，在治療15 d后，蜂針蜇刺5 min、1 min足腫脹體積有減小(P<0.05)，陽性對照藥組有顯著減小(P<0.01)；與模型組比較，在治療35 d后，蜂針蜇刺5 min、1 min、30 s、陽性對照藥組都有顯著減小(P<0.01)。

表2 各組大鼠的足體積比較

由表3可見，與模型組比較，在造模前一天，各治療組和空白組的足厚度都沒有差異；與模型組比較，在治療15 d后，蜂針蜇刺5 min、1 min、30 s 、陽性對照藥組的足厚度都有顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，在治療35 d后，蜂針蜇刺5 min、1 min、30 s、陽性對照藥組的足厚度都有顯著增高(P<0.01)。

表3 各組大鼠的足厚度比較

由表4可見，與模型組比較，在造模前1天，各治療組和空白組的足周長都沒有差異；與模型組比較，在治療15 d后，蜂針蜇刺5 min、1 min、30 s、陽性對照藥組的足周長都有顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，在治療35 d后，蜂針蜇刺5 min、1 min、30 s、陽性對照藥組的足周長都有顯著增加(P<0.01)。

表4 各組大鼠的足周長比較

2.3 各組大鼠的脾臟重量、胸腺重量比較

由表5可見，與模型組比較，蜂針蜇刺5 min、1 min脾臟重量有減小(P<0.05)，蜂針蜇刺30 s、陽性對照藥組有顯著減小(P<0.01)；與模型組比較，蜂針蜇刺5 min、1 min、30 s、陽性對照藥組胸腺重量都有顯著減小(P<0.01)。

表5 CIA模型脾臟、胸腺重量的比較

2.4 各組大鼠脾組織形態比較

由圖1可見，脾組織形態比較可見，空白組淋巴小結結構清晰，胞核胞漿界限分明。模型組淋巴小結結構基本破壞，伴隨著大量炎性細胞浸潤，并出現大量的出血點，部分細胞核溶解或破碎，淋巴細胞輕度增生，體積變大，白髓和紅髓界限不清晰。陽性對照藥組淋巴小結結構正常，胞核大小均一，排列整齊。蜂針蜇刺5 min組出血點明顯減少，淋巴小結結構基本恢復正常，紅髓結構有所恢復。蜂針蜇刺1 min組淋巴小結結構有所恢復，但不夠完整，局部區域出血點較多。蜂針蜇刺30 s組部分淋巴小結結構有所恢復，但部分淋巴細胞仍有增生現象。

3 討論

本研究表明，蜂針治療在鎮痛和抗炎作用上有明顯的意義，在類風濕模型大鼠上也有明顯的改善腫脹關節的作用和調節免疫的作用，同時還可以影響病變的骨組織。

蜂療主要是通過蜜蜂蜂針將蜜蜂體內的活性物質帶入人體內，現在研究表明，蜜蜂毒囊中主要成分是蜂毒，蜂毒是存在于蜜蜂毒囊中由毒腺分泌的無色芳香液體，其化學成分復雜，主要包括活性酶類(透明質酸酶、磷酸酯酶A2)、多肽類(蜂毒肽、蜂毒明肽、肥大細胞脫粒肽、鎮靜肽等)、糖類、脂類、氨基酸類和胺類物質等[6-7]。目前，蜂針蜂毒在臨床中有著非常廣泛的應用，涉及運動、呼吸、循環、神經、消化、內分泌、泌尿、生殖等各大系統，包括疼痛、炎癥、腫瘤、自身免疫病等多種疾病[8-14]。現代研究發現，蜂毒肽是人類目前發現的最強的抗炎物質之一，其抗炎強度是氫化可的松的100倍，具有類激素樣的作用，但卻沒有其副作用[7]。蜂毒肽可以刺激機體分泌皮質激素，阻止局部炎癥的發生[1]。

類風濕性關節炎是一種以關節紅腫熱痛、晨僵、胃納不佳的慢性系統性疾病。疾病晚期會出現關節畸形, 活動受限, 甚至導致肢體永久性殘疾。其病因未明，考慮可能與遺傳、感染、性激素等有關。其治療目前主要分為西醫和中醫兩方面, 西醫通常是采用抗炎鎮痛、免疫抑制等方法, 其優勢是可以暫時控制住病情的發展, 但存在具有較大的毒副作用等缺點。而中醫方面主要是中藥內服、外敷、針灸、穴位注射等。隨著中醫治療的發展，其治療效果有很大的進步，同時可以有效地減少不良反應的發生。其中近期臨床研究發現，蜂針蜇刺治療在臨床上有很大的應用空間，不但可以取得良好的治療效果，也可以減少毒副作用帶來的痛苦[9，15-18]。

圖1 蜂針蜇刺對CIA大鼠脾臟組織的影像(HE，×100)

本研究的目的就是在實驗層面上驗證蜂針蜇刺的效果，通過實驗發現，蜂針蜇刺治療可以有明顯的鎮痛抗炎作用，同時對類風濕模型大鼠的足腫脹、足周長、足厚度、脾臟重量、胸腺重量、脾臟組織病理結構有明顯改變，提示蜂針蜇刺治療有可能在炎癥抑制上有很好的作用效果，但仍需要更進一步的機制研究來進行驗證。綜上所述，蜂針蜇刺治療可以有效改善類風濕模型大鼠的疾病情況，為以后在機制層面更好的進行研究提供基礎依據。