基于合相色譜技術的麻黃多糖干預肺損傷小鼠糞便中短鏈脂肪酸測定方法的開發

魏禎，苑宏宇，劉俊希，梁軍，夏永剛

(黑龍江中醫藥大學 教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

麻黃最早記載于《神農本草經》，其性溫，味辛微苦，歸肺、膀胱經，具有發汗解表，宣肺平喘，利水消腫等功效[1]。現代藥理學研究表明，麻黃多糖對急性肺損傷，哮喘等肺部疾病都具有良好的治療作用。基于中醫基礎理論“肺與大腸相表里”，臨床研究發現肺部疾病與腸道疾病伴隨發生，經研究發現麻黃多糖對肺部疾病有較好的治療作用，同時對腸道微生物和短鏈脂肪酸(SCFAs)具有一定的影響[2]。SCFAs是一種少于6個碳原子的飽和脂肪族脂肪酸。由于SCFAs的代謝、神經調節和免疫調節作用，SCFAs在穩態中起著重要的作用。它們可以影響腸道微生物的生長和組成，從而進一步影響宿主的健康[3]。SCFAs不僅是結腸細胞的主要能量來源，過量的SCFAs還具有其他功能，如提供日常卡路里需求和參與碳水化合物和脂肪等重要營養物質的代謝[4]。常見的SCFAs包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸和異己酸。結腸腔中的SCFAs是重要的有機酸陰離子，主要由碳水化合物發酵產生[5]，也可能由蛋白質和氨基酸分解產生[6]。研究表明，在一定濃度范圍內，短鏈脂肪酸可促進細胞生長，改善腸道功能，影響心血管代謝，并具有抗炎、抗腫瘤活性[7]；此外，SCFAs與炎癥性腸病[8]、結直腸癌[9]、阿爾茨海默病[10]和2型糖尿病(T2DM)[11]以及肥胖[12]等疾病密切相關，它們在調節結腸免疫功能和能量代謝方面起著至關重要的作用[13]。因此，對SCFAs的定性和定量研究有助于闡明飲食、腸道菌群和宿主代謝穩態之間的復雜相互作用，這對于相關疾病的診斷和治療也起著至關重要的作用[14]。故SCFAs分析方法的開發在多個領域發揮著重要作用。

由于SCFAs的高極性和寬濃度范圍,以及糞便樣品基質的復雜性，對其進行分析是一個重大挑戰。目前，常見的SCFAs定量方法包括氣相色譜法(GC)[15]，高效液相色譜法(HPLC)[16]，液相色譜-質譜法(LC-MS)[17]和毛細管電泳法(CE)[18]。上述方法大多使用許多對環境和人類健康有害的有機溶劑和試劑。此外，復雜的衍生操作增加了反應時間，降低回收率，影響方法的準確性和重復性。超高效合相色譜(Ultra Performance Convergence Chromatography，UPCC或UPC2)不同于傳統的氣相色譜與液相色譜[19-20]，其主要的優點是用低成本且無毒的CO2代替了有毒的揮發性有機溶劑，不僅減少廢液處理環節，而且還保護了環境和實驗人員的身體健康。通過數據庫檢索，目前尚未發現在國內外有科研人員采用超高效合相色譜法進行SCFAs的檢測，因此，本研究擬開發一種簡便、環保、準確度高、重復性好的SCFAs測定方法，并首次建立基于UPC2的SCFAs定性定量的分析方法測定麻黃多糖干預PM 2.5所致肺損傷小鼠糞便中短鏈脂肪酸的含量，通過對該方法的精密度、準確度和回收率的表征，證明了該方法可用于準確定量測定小鼠糞便中SCFAs，為研究動物體內SCFAs類化合物的代謝提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物

BALB/c小鼠，SPF級，雌性，體質量18～20 g，購于遼寧長生生物技術股份有限公司，質量合格證書編號：SCXK(遼)2020-0001。實驗室溫度為22～24 ℃，濕度50%，明暗交替，自由飲水。本實驗符合實驗動物倫理委員會的倫理學標準。

1.2 藥物與試劑

異己酸、2-甲基丁酸、異丁酸、異戊酸、丙酸、乙酸標準品(美國CFW Laboratories公司，批號分別為：0606071-AS，4109261-AS，1208261-AS，4402071-AS，8014271-AS，0402161-AS)，丁酸標準品(美國Nu-Chek Prep公司，批號：N-4A-J5-B)，戊酸(美國CFW Laboratories公司)，二氯甲烷(天津星馬克科技發展有限公司)，甲醇，乙腈色譜級(美國Fisher公司)，水為超純水，其余均為分析純，高純度CO2(哈爾濱卿華工業氣體有限公司)，PM 2.5(哈爾濱市環境監測中心)，卵白蛋白(OVA，美國sigma公司)，麻黃購于山西大同藥材公司，經黑龍江中醫藥大學藥用植物學教研室蘇連杰教授鑒定為麻黃科植物草麻黃(EphedrasinicaStapf)的干燥草質莖，符合2020版《中國藥典》相關規定，麻黃多糖(自制)。

1.3 儀器

本次實驗使用ACQUITY UPC2(Waters, Milford, MA, USA)色譜系統，帶有二氧化碳和助溶劑供應的二元泵，自動進樣器，柱恒溫器，自動背壓調節器(ABPR)和PDA檢測器。TorusTMDEA色譜柱(3.0 mm×150 mm,1.7 μm)，Viridis BEH色譜柱(2.1 mm×150 mm,1.7 μm)，Viridis CSH Fluoro-Phenyl色譜柱(3.0 mm×150 mm,1.7 μm)，TorusTMDIOL色譜柱(3.0 mm×150 mm,1.7 μm)，TrefoilTMAMY1色譜柱(3.0 mm×150 mm,2.5 μm)，Viridis BEH-2EP色譜柱(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)以及TorusTM2-PIC色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)(美國Waters公司)。Milli-Q型超純水系統(美國Millipore公司)。

2 方法與結果

2.1 標準溶液的配置

精密稱取8種有機酸標準品，加入乙腈溶解，配置得混合標準品母液濃度為60 mg/mL，稀釋母液至濃度為0.25，0.5，1，2，4，8，10，16，40，60 mg/mL，0.22 μm有機濾膜過濾后，直接進行超高效合相色譜分析。這些混合標準品溶液用于優化實驗條件，并構建SCFAs定量的標準曲線。

2.2 動物實驗分組及給藥

將小鼠隨機分為空白組、模型組、給藥組，每組10只。經過1周的適應性喂養后，模型組與給藥組小鼠分別在第1，8，15天腹腔注射OVA(濃度0.5 mg/mL)致敏，空白組小鼠腹腔注射生理鹽水；給藥組于第17天開始每日給藥麻黃多糖，給藥劑量為100 mg/kg (空白組與模型組給予同劑量的生理鹽水)，給藥10 d；模型組，給藥組于第22天先采用OVA溶液(濃度10 mg/mL)霧化30 min，再用自制的PM 2.5分散液(濃度10 mg/mL)進行霧化激發30 min(同時空白組采用生理鹽水霧化處理)；造模結束后直接接取小鼠糞便于無菌離心管中，立即放入-80 ℃冰箱儲存。

2.3 短鏈脂肪酸樣品的處理方法

根據ZHANG[21]等人對糞便樣品中SCFAs的預處理方法在本次實驗中進行了優化。將收集的糞便樣品經冷凍干燥后，研磨制成粉末。精密稱取不同樣本中小鼠糞便100 mg置5 mL離心管中，加入2 mL 1 mol/L稀鹽酸提取，渦旋10 min，充分混勻，超聲提取10 min后，在12 000 r/min 4 ℃條件下離心15 min，取1 mL上清液移入5 mL離心管中，0.22 μm水膜過濾，加1 mL二氯甲烷萃取，靜置5 min后，在12 000 r/min 4 ℃條件下離心15 min，取下層，0.22 μm有機濾膜過濾，進行SCFAs檢測。

2.4 色譜柱篩選

色譜柱篩選試驗的目的是選擇合適的色譜柱進一步優化方法。篩選試驗的標準是8種標準品有機酸的峰形，峰寬以及分離率。混合標準品按照“2.1”項下制備后，對7種不同類型的Acquity UPC2色譜柱進行了評價，包括TorusTMDEA 色譜柱(3.0 mm×150 mm,1.7 μm)，Viridis BEH色譜柱(2.1 mm×150 mm,1.7 μm)，Viridis CSH Fluoro-Phenyl色譜柱(3.0 mm×150 mm,1.7 μm)，TorusTMDIOL色譜柱(3.0 mm×150 mm,1.7 μm)，TrefoilTMAMY1色譜柱(3.0 mm×150 mm,2.5 μm)，Viridis BEH-2EP色譜柱(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)以及TorusTM2-PIC色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)，流動相A為CO2，流動相B為5%水-甲醇，色譜條件為：柱溫:50 ℃，進樣量:5 μL，流速:0.7 mL/min，檢測波長：217 nm。梯度洗脫條件：0～2 min，10%B～18%B；2～5 min，18%B～20%B；5～8 min，20%B～50%B；8～10 min，50%B；在下一次注入之前重新平衡時間為5 min。

由圖1可知，8種SCFAs在不同的固定相上的色譜行為差別較大，其中僅DEA分離效果最佳，因此，確定SCFAs分析最佳色譜柱是DEA。

注：1.異己酸;2.2-甲基丁酸;3.異丁酸;4.異戊酸;5.戊酸;6.丁酸;7.丙酸;8.乙酸;A.AMY1;B.BEH-2EP;C.BEH;D.CSH;E.DIOL;F.2-PIC;G.DEA。圖1 不同固定相上的色譜行為

2.5 流動相篩選

試驗的目的是選擇合適的流動相進一步優化方法，使8種標準品有機酸具有較好的峰形、峰寬以及分離率。混合標準品按照“2.1”項下制備后，對以下流動相進行考察，包括純甲醇，50%乙腈-甲醇，0.2%磷酸-甲醇，50%異丙醇-甲醇，2.5%水-甲醇，5%水-甲醇。對流動相篩選試驗色譜條件為：柱溫:50 ℃，進樣量:5 μL，流速:0.7 mL/min，檢測波長：217 nm；梯度洗脫條件：0～5 min，10%B；5～10 min，10%B～50%B；在下一次注入之前重新平衡時間為5 min。

由圖2可知，8種SCFAs經不同的有機相洗脫，洗脫速率有顯著差異，其中5%水-甲醇分離效果最佳，可以看到8個標準品峰，因此，確定SCFAs分析最佳有機相是5%水-甲醇。

注：1.異己酸;2.2-甲基丁酸;3.異丁酸;4.異戊酸;5.戊酸;6.丁酸;7.丙酸;8.乙酸;A.甲醇;B.50%乙腈-甲醇;C.50%異丙醇-甲醇;D.0.2%磷酸-甲醇;E.2.5%水-甲醇;F.5%水-甲醇。圖2 不同流動相的色譜行為

2.6 流速選擇

UPC2采用超臨界流體CO2作為主要流動相，因其具有液體的高密度及氣體低黏度的雙重特點，以及介于氣體與液體之間的擴散系數特征，使流動相在分離過程中具有較高的線速度[22]。本次實驗在0.6～1.0 mL/min范圍內對流速進行優化。混合標準品按照“2.1”項下制備后，采用ACQUITY UPC2(Waters Corp,USA)系統分析，色譜條件按照“2.4”項下所示。

由圖3可知，8種SCFAs經不同的流速洗脫，隨著流速的不斷升高，分析時間不斷縮短，但同時系統壓力也隨之增大，使儀器損壞的風險不斷升高，同時考慮到對色譜柱的維護，并且為了使系統壓力保持在較低水平，且具有較短分析時間，保證SCFAs具有良好的分離度與峰型，本研究選擇的流速為0.7 mL/min。

注：1.異己酸;2.2-甲基丁酸;3.異丁酸;4.異戊酸;5.戊酸;6.丁酸;7.丙酸;8.乙酸;A.0.6 mL/min;B.0.7mL/min;C.0.8 mL/min;D.0.9 mL/min;E.1.0 mL/min。圖3 流速對短鏈脂肪酸分離選擇性的影響

2.7 動態背景壓力(ABPR)的選擇

在超高效合相色譜(UPC2)中，其動態的背景壓力(ABPR)控制CO2使其處于超臨界流體狀態，是影響分離過程的重要因素之一。在不同的ABPR下，超臨界流體CO2對各種待測物有著不同的溶解能力。當背壓升高時，超臨界流體密度會增大，溶劑化能力增強，柱壓升高[23]。本研究考察了ABPR為1 500，1 700，1 900，2 100 ，2 300 psi時，超臨界流體對待測物分離的影響。混合標準品按照“2.1”項下制備后，采用ACQUITY UPC2(Waters Corp., USA)系統分析，色譜條件按“2.4”項下所示。由圖4可知，8種SCFAs在不同的背景壓力下洗脫，色譜行為差異較小，考慮到色譜柱的維護，確定SCFAs分析最佳背景壓力是1 500 psi。

注：1.異己酸;2.2-甲基丁酸;3.異丁酸;4.異戊酸;5.戊酸;6.丁酸;7.丙酸;8.乙酸;A.1 500 psi;B.1 700 psi;C.1 900 psi;D.2 100 psi;E.2 300 psi。圖4 背景壓力對短鏈脂肪酸分離選擇性的影響

2.8 梯度優化

由于SCFAs為極性化合物，因此必須使用有機改性劑來增加流動相的極性。甲醇具有良好的洗脫強度，是最常用的助溶劑之一[24]。甲醇梯度程序是影響SCFAs在UPC2中分析時間的最關鍵參數之一。為了選擇合適的梯度，考慮了梯度條件(包括梯度時間，流動相初始濃度和最終濃度)。助溶劑的最初濃度為10%，最終濃度為20%，可以保證峰形及不同化合物之間的分離度。同時，隨著梯度時間的減少，峰寬略有改善，而隨著流動相濃度的升高，分析時間縮短。混合標準品按照“2.1”項下制備后，采用優化的儀器方法，進一步優化洗脫梯度，得到最優色譜條件，對照品色譜圖如圖5所示。

注：1.異己酸;2.2-甲基丁酸;3.異丁酸;4.異戊酸;5.戊酸;6.丁酸;7.丙酸;8.乙酸。圖5 UPC2考察SCFAs的色譜圖

2.9 最優色譜條件

采用ACQUITY UPC2(Waters Corp,USA)系統，包括色譜柱管理器，二元溶劑管理器，樣品管理器，等度溶劑管理器，PDA檢測器。定量分析采用ACQUITY UPC2TorusTMDEA(3.0 mm×150 mm,1.7 μm )色譜柱進行，柱溫:50 ℃，進樣量:5 μL，流速:0.7 mL/min，檢測波長：217 nm，流動相A為CO2，流動相B為5%水-甲醇。梯度洗脫條件，梯度洗脫條件：0～2 min，10%B～18%B；2～5 min，18%B～20%B；在下一次注入之前重新平衡時間為5 min。

2.10 方法學考察

2.10.1 標準曲線、最低檢測限及最低定量限

精密移取，按“2.1”項下制備的不同濃度的混合標準品工作液，每個質量濃度點分別進樣3次，以質量濃度C(mg/mL)為橫坐標，平均峰面積值A為縱坐標，繪制標準曲線。以S/N=3和S/N=10分別確定其最低檢測限和最低定量限。所測得SCFAs的最低檢測限、最低定量限、線性范圍及回歸方程見表1。

表1 SCFAs的回歸方程、最低檢測限、最低定量限、線性范圍

2.10.2 精密度試驗

精密移取，按“2.1”項下配制的標準品溶液，測定有機酸化合物的日內和日間精密度。所得異己酸、2-甲基丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸、丁酸及丙酸8種有機酸化合物日內精密度RSD值分別為3.77%、3.18%、2.68%、6.76%、2.87%、4.26%、1.87%、3.91%，日間精密度RSD值分別為7.93%、6.43%、7.26%、7.51%、5.92%、4.74%、3.06%、6.02%，表明該儀器精密度良好。

2.10.3 重復性試驗

取同一批小鼠糞便供試品適量，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.9”項下色譜條件進樣測定，計算得到異丁酸、異戊酸、戊酸、丁酸、乙酸的RSD值分別為3.38%、6.78%、6.24%、3.10%、1.97%，表明該方法重復性良好。

2.10.4 穩定性試驗

按“2.3”項下制備的同一批供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h進樣，按“2.9”項下色譜條件進樣測定，測得異丁酸、異戊酸、戊酸、丁酸、乙酸5種有機酸化合物標準品中峰面積RSD值分別為6.62%、7.56%、3.35%、5.02%、3.51%，表明標準品溶液在4 ℃條件下放置24 h穩定性較好。

2.10.5 加標回收率試驗

取已知含量的糞便樣品，加入“2.1”項下制備的一定質量濃度的標準品溶液，經前處理及UPC2分析后，測得糞便樣品中所含異丁酸、異戊酸、戊酸、丁酸、乙酸的加標回收率分別為90.98%、95.03%、92.89%、102.42%、93.93%，RSD值分別為6.96%、3.58%、5.91%、2.02%、5.64%，表明該方法具有較好的準確度，可以滿足后續實驗要求。

2.11 樣品測定

按“2.3”項下的方法對小鼠糞便樣品進行預處理，再采用“2.9”項下方法進行UPC2檢測，樣品各組間SCFAs含量及顯著性差異如表2所示。與空白組比較，模型組小鼠糞便SCFAs中異丁酸和戊酸含量顯著升高(P<0.01)，乙酸含量有所升高，但不具有統計學意義(P>0.05)，其中異戊酸和丁酸含量呈現降低的趨勢，不具有統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，給藥組小鼠糞便SCFAs中異丁酸、戊酸和乙酸含量均顯著降低(P<0.05，P<0.01，P<0.05)，其中異戊酸和丁酸含量呈現升高的趨勢，不具有統計學意義(P>0.05)。

表2 小鼠糞便中SCFAs的分布情況

3 討論

本實驗開發了一種快速、高效、經濟、環保、低耗，安全的定量分析SCFAs的新方法。在分析時間方面，目前的UPC2方法與HPLC及GC的方法相比，具有一定優勢。通過UPC2對常見的8種SCFAs的分析進行了驗證，對SCFAs的極性物質進行分析，具有較好的重現性和較快的分析速度。通過對PM 2.5所致急性肺損傷給藥麻黃多糖后的小鼠糞便中短鏈脂肪酸的研究，其結果表明，UPC2對于測定SCFAs等酸性化合物可以作為一種新的研究方法。該方法從生物樣品中分離測定SCFAs，具有以下優點：不需要衍生，操作簡單，節省時間，所需的樣品和溶劑較少以及具有良好的重現性。

因此，通過UPC2建立的新型SCFAs的檢測方法不僅可以高效、準確地對其進行分離分析，而且能夠促進人們對其在機體代謝中所發揮作用的認識，有助于推動與SCFAs相關的臨床研究[25]，也為超高效合相色譜在測定不同生物樣品中短鏈脂肪酸中的應用提供了技術支持，為短鏈脂肪酸的含量測定研究提供了新思路。同時，UPC2是改善分離條件的補充工具，如果串聯質譜檢測器，其所呈現出的靈敏度與選擇性，將較本文討論的UPC2-UV具有更大的優勢，其將是一種很有前景的短鏈脂肪酸分析方法。