LC-MS/MS法測定東北黃精灌胃后大鼠血漿中3種皂苷類化合物含量及其藥代動力學研究

崔芙巖，黃金月，姜佳欣，唐檬，馬鷹，鄭時嘉，于純淼，王志剛，楊波*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.天問山農業(yè)綜合開發(fā)股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150300)

黃精為常用中藥，在我國用藥歷史悠久，具有多種藥理作用，長期應用于治療肺虛燥咳、體倦乏力、腎虛虧損等，也應用于治療糖尿病、慢性肝炎、結核病等疾病[1-3]。中藥黃精的化學成分較為復雜，主要化學成分有皂苷、黃酮類、多糖、氨基酸等。皂苷成分中，主要以人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷為主，也有文獻報道測定黃精中的菝葜皂苷元，皂苷類化合物具有抗菌抗炎、抗腫瘤、防治心血管疾病等藥理作用[4-10]。近些年，黃精中的皂苷類成分一直是黃精藥物研究的關鍵。經研究證明，東北黃精因種植環(huán)境的不同，與其他地區(qū)黃精相比，其化學成分及含量有所不同[11-13]。東北黃精亦是一種藥食兩用的中藥資源，具有極高的藥用價值和保健作用[14]。

本研究中，東北黃精大鼠灌胃后采取96孔板血漿處理技術[15-16]，應用液質聯(lián)用(MRM法)測定大鼠血漿中薯蕷皂苷、人參皂苷Rb1和菝葜皂苷元的濃度，研究人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷和菝葜皂苷元的藥代動力學，為黃精的中醫(yī)臨床應用提供理論數據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫超高液相色譜儀(Agilent 1200)；安捷倫三重四級桿質譜儀(Aglient 6410)；96孔板處理器(美國瓦里安公司)；BT-25 電子分析天平(德國 Sartourious公司)；Milli-Q Gradient A10超純水器(美國Millipore公司)；人參皂苷Rb1對照品(中國食品藥品鑒定研究院，20200906);薯蕷皂苷對照品(中國食品藥品鑒定研究院，20200603)；菝葜皂苷元對照品(中國食品藥品鑒定研究院，20200618)；甘草次酸對照品(中國食品藥品鑒定研究院，20200523)；東北黃精生藥材(黑龍江省天問山農業(yè)綜合開發(fā)股份有限公司，經黑龍江中醫(yī)藥大學孫慧峰教授鑒定為百合科植物黃精)；甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，德國默克公司)；正丁醇、乙酸乙酯(分析純，天津富宇精細化工有限公司)。

1.2 實驗動物

SD大鼠，體質量(250±20)g，雌雄各半，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供；飼養(yǎng)溫度為(25±2)℃，濕度為(50±2)%，采用12 h交替光照，適應性飼養(yǎng)兩周，實驗前禁食不禁水12 h。

1.3 溶液的制備

1.3.1 對照品溶液

精密稱取人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷和菝葜皂苷元對照品各10 mg，分別置于10 mL的容量瓶中，用甲醇溶解后稀釋至刻度，混勻，制成濃度為1 mg/mL的對照品溶液(儲備液)。精密稱取人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷和菝葜皂苷元儲備液適量，配置成濃度為20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的標準溶液。用大鼠空白血漿進行稀釋，得到濃度分別為1、2.5、5、10、25、50、100、250 ng/mL濃度的血漿標準工作液。

1.3.2 內標溶液

精密稱取10 mg甘草次酸對照品，放于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解、稀釋至刻度后混勻，制得1 mg/mL的甘草次酸儲備液。稱取甘草次酸儲備液適量，制得200 ng/mL的甘草次酸內標溶液。

1.3.3 黃精提取液

稱取黃精干燥根莖，粉碎后過4號篩，以15倍量的75%乙醇加熱回流提取兩次(1.5 h/次)，合并兩次濾液，采用0.25 μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液用0.9%氯化鈉溶液稀釋10倍，備用。

1.3.4 質控溶液

精密稱取人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷和菝葜皂苷元儲備液適量，用空白血漿進行稀釋，制備濃度為5、50、200 ng/mL的人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷和菝葜皂苷元樣品溶液。

1.4 色譜、質譜條件

1.4.1 色譜

色譜柱：安捷倫 SB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流動相：A甲醇-B 0.1%甲酸溶液(70∶30)等度洗脫；柱溫：30 ℃；流速：0.2 mL/min；進樣量：5 μL。

1.4.2 質譜

使用電噴霧離子源，掃描方式為多級反應檢測(MRM)，在正離子模式下進行數據采集。正離子模式下質譜條件：毛細管電壓：3.5 KV；干燥器：N2；干燥器溫度：350℃；去溶劑流量：10 L/min；檢測離子對：人參皂苷Rb1(m/z 1131.6→365.7)，薯蕷皂苷(m/z 890.5→721.3)，菝葜皂苷元(m/z 439.7→417.6)，內標甘草次酸(m/z 491.5→425.3)；碰撞電壓：人參皂苷Rb1為65 eV，薯蕷皂苷為50 eV，菝葜皂苷元為40 eV，內標甘草次酸為50 eV。

1.5 生物樣品的制備

取100 μL血漿標準工作溶液、空白血漿及質控樣品，分別加入96孔板，除空白血漿外分別加入5 μL的內標工作溶液，渦旋5 min后，加入10 μL NaOH溶液(0.1 mol/L)，繼續(xù)渦旋1 min。混勻后加入0.5 mL正丁醇，反復振搖、混合均勻后，2 000 r/min離心10 min，-20 ℃冷凍2 h，取0.4 mL上層溶液，以氮氣吹干，取100 μL流動相復溶。

1.6 動物分組及給藥

SD大鼠6只，雌雄各半，作為實驗組，禁食不禁水12 h，灌胃東北黃精提取液。空白組灌胃給予蒸餾水，給藥前及給藥后0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48 h，通過眼眶取0.5 mL血后放于肝素鈉離心管，離心后制備血漿，藥動學參數采用Winnorlin軟件進行處理。

2 結果與討論

2.1 液相色譜-質譜條件優(yōu)化

優(yōu)化液相色譜條件時，結合保留時間、分離度、拖尾因子等因素，對流動相和洗脫梯度進行考察。綜合考慮，選擇甲酸水和甲醇作為流動相，梯度為70∶30。在數據采集模式考察中，通過比較人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、菝葜皂苷元和內標甘草次酸在正離子掃描模式和負離子掃描模式下的響應值，結果正離子響應值較高，所以本研究選擇正離子模式采集數據。經優(yōu)化，人參皂苷Rb1最佳碰撞電壓為65 eV，薯蕷皂苷為50 eV，菝葜皂苷元為40 eV，甘草次酸為50 eV。通過一級質譜全掃描，薯蕷皂苷、人參皂苷Rb1、菝葜皂苷元和甘草次酸的[M+Na]+分別為m/z 890.5、1131.5、439.7和491.5。經二級質譜全掃描可發(fā)現并確定人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、菝葜皂苷元和內標甘草次酸的定量離子反應對分別為m/z 1 131.6→365.7、m/z 890.5→721.3、m/z 439.7→417.6、m/z 491.5→425.3。人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、菝葜皂苷元和內標甘草次酸的一、二級質譜圖結果見圖1。

注：A.人參皂苷Rb1一級;B.人參皂苷Rb1二級;C.薯蕷皂苷一級;D.薯蕷皂苷二級;E.菝葜皂苷元一級;F.菝葜皂苷元二級;G.內標一級；H.內標二級。圖1 一級、二級質譜圖

2.2 專屬性

考察血漿樣品所需萃取溶劑時，發(fā)現正丁醇的提取效率最高，血漿生物樣品所受的基質干擾效應最少，故選擇正丁醇作為本次生物樣品的提取溶劑。將血漿樣品按“1.5”項下方式進行處理，經LC-MS/MS法檢測后，色譜圖結果見圖2。結果表明，薯蕷皂苷、人參皂苷Rb1、菝葜皂苷元和甘草次酸的保留時間分別為3.3 min、3.5 min、4.0 min及2.8 min，無內源性成分干擾目標化合物的檢測。

注：A.空白血漿(m/z 1131.6→365.7);B.樣品血漿(m/z 1131.6→365.7)；C.空白血漿(m/z 890.5 →721.3);D.樣品血漿(m/z 890.5→721.3)E.空白血漿(m/z 439.7→417.6);F.樣品血漿(m/z 439.7→417.6);G.空白血漿(m/z 491.5→425.3);H.樣品血漿(m/z 491.5→425.3)。圖2 大鼠血漿樣品MRM掃描色譜圖

2.3 線性方程、線性范圍和定量限

按“1.5”項下生物樣品的制備方法，分別取100 μL空白血漿，精密加入不同量的人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、菝葜皂苷元和內標工作溶液5 μL，得對照品溶液(薯蕷皂苷濃度分別為20、40、80、120、160、220 ng/mL，人參皂苷Rb1濃度為5、10、20、40、100、200 ng/mL，菝葜皂苷元為10、20、40、60、100、150 ng/mL)。每種濃度平行5份樣品，取以上對照品混合溶液10 μL進樣，以各皂苷化合物與甘草次酸峰面積比為縱坐標，以濃度為橫坐標，按“1.4”項下方法測定，利用加權(1/x)最小二乘法分別得出薯蕷皂苷、人參皂苷Rb1及菝葜皂苷元的回歸方程(表1)。3種皂苷線性范圍分別為5～200 ng/mL、20～220 ng/mL、10～150 ng/mL，且線性關系良好。

表1 3種皂苷的線性考察(n=5)

2.4 準確度和精密度

測定“1.3.4”項下制備的質控溶液，通過測定皂苷類化合物低、中、高濃度質控樣品計算血漿樣品中人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、菝葜皂苷元的準確度和精密度，結果見表2。

表2 精密度和準確度考察(n=5)

2.5 提取回收率和基質效應

提取回收率是綜合評價生物樣品分析方法的重要指標，其反應生物樣品中目標化合物的提取效率[17]。考察基質效應有柱后灌流和標準添加兩種方法[18-21]。本研究采用標準添加法考察樣品的基質效應。

按“1.3.4”測定5、50、200 ng/mL 3個濃度的大鼠血漿質控樣品，經測定得峰面積為A1；需要加入對應濃度純標準品溶液，經測定峰面積為A2；空白血漿樣品加入對應濃度純標準品后，經測定峰面積為A3；計算回收率和基質效應，回收率為A1與A3的比值，基質效應為A3與A2的比值，見表3。該分析方法提取回收率良好，基質干擾效應小。

表3 血漿中人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、菝葜皂苷元回收率與基質效應值

2.6 穩(wěn)定性

考察5、50、200 ng/mL 3個濃度的質控生物樣品分別在25 ℃環(huán)境下放置4 h、冷凍放置(-20 ℃)30 d、凍融循環(huán)(3次)后的穩(wěn)定性，見表4。血漿樣品中人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷及菝葜皂苷元在各放置條件下均有較好穩(wěn)定性。

表4 大鼠血漿中人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、菝葜皂苷元穩(wěn)定性

2.7 大鼠灌胃黃精提取液后3種皂苷化合物的藥代動力學研究

利用所建立的液相色譜-串聯(lián)質譜方法，對東北黃精提取液灌胃后大鼠血漿樣品中皂苷類成分進行濃度測定。以給藥時間作為橫坐標，血藥濃度為縱坐標，繪制3種皂苷類成分的藥時曲線。應用Winnorlin軟件以非房室模型進行統(tǒng)計學處理，并計算藥代動力學參數，結果見圖3。

圖3 給藥后血漿中人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷和菝葜皂苷元的血藥濃度-時間曲線

結果顯示，人參皂苷Rb1在大鼠體內血藥濃度的達峰時間tmax為(2.03±0.32)h，半衰期t1/2為(8.57±0.53)h，最大血藥濃度Cmax為(90.37±21.08)ng/mL，AUC0～24為(1 095.83±87.36)(ng·h)/mL；薯蕷皂苷的達峰時間tmax為(1.91±0.54)h，半衰期t1/2為(7.34±0.68)h，最大血藥濃度Cmax為(55.21±20.12)ng/mL，AUC0～24為(735.65±64.36)(ng·h)/mL；菝葜皂苷元在大鼠體內血藥濃度的達峰時間tmax為(1.16±0.19)h，半衰期t1/2為(6.85±0.52)h，最大血藥濃度Cmax為(136.27±39.05)ng/mL，AUC0～24為(1648.96±103.26)(ng·h)/mL。

3 結論

目前，對黃精的研究多集中在皂苷、黃酮及多糖成分的分離、鑒定和藥理作用相關機制，但對黃精主成分的體內過程及藥代動力學研究較少。本研究首次利用LC-MS/MS法對大鼠灌胃給予黃精提取物后血漿中3種皂苷類成分的血藥濃度進行了測定。本研究應用96孔板系統(tǒng)制備大鼠血漿生物樣品，高效進行多個樣品的處理；采用專屬性強、靈敏度高的MRM掃描方式，縮短了樣品分析時間。同時，經過測定條件優(yōu)化和方法學驗證，最終利用該方法對3種皂苷成分的藥代動力學進行了研究，為黃精體內有效成分的確定提供了基礎數據，也為東北黃精的質量控制和資源開發(fā)提供參考。