接骨木提取物對酒精性骨重構大鼠模型骨代謝、骨穩態及骨凋亡的實驗研究

申意偉，李雪，李毅，范楨亮，李佐，楊冰佑

(1.黑龍江中醫藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院,黑龍江 哈爾濱 150001；3.北藥基礎與應用研究教育部重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150040；4.東北師范大學生命科學院,吉林 長春 130024；5.浙江省中醫院腎病科,浙江 杭州 310006)

酒精性骨重構(Alcoholic Bone Remodeling，ABR)是以全身骨質和骨量異常為特征[1-2]，是酒精誘導骨組織細胞異常代謝而導致骨穩態失衡的綜合反映，表現為骨髓間充質干細胞、成骨細胞、破骨細胞、骨細胞等活性和功能異常[3]，破壞了成骨/破骨生理平衡，破壞了骨生物力學性能[4]，是酒精性骨壞死、酒精性骨質疏松癥[5-6]等的共同病理過程。接骨木(SambucuswilliamsiiHance)系忍冬科接骨木屬植物，又名續骨木、鐵骨散、舒筋樹，為落葉灌木或喬木，分布于中國，韓國和日本的不同地區，其天然資源極為豐富。接骨木為民間骨病治療常用藥，已有數千年歷史，其性味甘苦平，無毒，具有祛風利濕、活血止痛等功效，具有抗炎鎮痛、抗氧化等作用，主要用于治療骨質疏松[7]、骨折[8]、跌打腫痛及創傷出血等病癥[9-10]。在前期研究證實接骨木促進骨折愈合、抗炎癥、抗氧化及改善骨穩態的基礎上[8,11-13]，本研究擬進一步采用酒精腹腔注射復制酒精性骨重構大鼠模型，從骨代謝、骨穩態及骨凋亡等角度評價接骨木對酒精性骨紊亂的干預作用，為臨床防治酒精性骨病提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

10周齡雄性SD大鼠30只，清潔級，體質量205～245 g，由遼寧沈陽長生科技有限公司提供，實驗動物質量合格證編號：SCXK(遼)2015-0001。屏障系統條件下[實驗動物使用許可證：SYXK(黑)2016004]，標準顆粒飼料喂養，周期照明，室內室溫 20～25 ℃，相對濕度 40%～70%，實驗期間動物自由飲食和飲水。

1.1.2 儀器

酶標儀，杭州奧盛儀器有限公司(型號：AMR-100)；大小鼠電子秤，北京冀諾泰科技發展有限公司(型號：JNT-DC)；實時PCR系統，美國Applied Bio-Systems Instruments公司(型號：ABI 7900HT)；電泳儀，美國Electrophoresis Power Supply公司(型號： EPS 301GE)；分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific公司(型號：NanoDrop 2000C)；顯微鏡，日本Nikons公司(型號：Eclipse Ci-L) ，雙色紅外熒光成像系統，美國LI-COR Odyssey公司(型號：ODY-2569)。

1.1.3 藥品與試劑

1.1.3.1 接骨木提取物制備方法

干燥的接骨木根皮(5 kg)，經95%乙醇(75 L)回流提取2次，每次2 h，過濾，合并提取液，濃縮干燥得乙醇提取物(264 g)。將乙醇提取物加水溶解，經AB-8大孔吸附樹脂柱色譜柱，用20倍樹脂床體積的蒸餾水洗去糖等水溶性雜質，用50%乙醇、95%乙醇依次洗脫，減壓回收50%乙醇洗脫液，即為本研究供試藥品(105 g)，已經證明為接骨木主要藥效部位及組分[8,11]。

1.1.3.2 試劑

無水乙醇(致遠化學科技有限公司，批號20171113)；切片石蠟(匯恒化工科技有限公司，批號39601095)；中性樹膠(索萊寶科技有限公司，批號20190827)；中性福爾馬林固定液(索萊寶科技有限公司，貨號: G2161)；改良HE染色試劑盒(索萊寶科技有限公司，貨號:G1121)；RIPA緩沖液(碧云天生物技術公司，批號：P0013B)；BCA蛋白質測定試劑盒(碧云天生物技術公司，批號：P0012)；QuickBlockTMWestern封閉液(碧云天生物技術公司，貨號：P0252)；TRIzol試劑(美國Invitrogen公司，批號：15596018)；逆轉錄試劑盒(美國Promega公司，批號：A5000)；實時定量PCR反應體系試劑盒(美國Promega公司，批號：A6010)。Anti-Cleaved Caspase-3抗體(Abcam ,ab49822)、重組Anti-Caspase-3抗體(Abcam ,ab224271)、重組Anti-Bax抗體 (Abcam ,ab32503)、Anti-beta Actin抗體(Abcam，ab8226)。維生素D(VD)檢測試劑盒(美國ImmunoClone(I&C)公司，貨號：ZY-VD-Ge)；大鼠IGF-1檢測試劑盒(上海康朗生物科技有限公司，貨號：im-E30653)；大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶(ACP5)酶聯免疫吸附測定試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號：E-EL-R0939c)；大鼠骨鈣素/骨谷氨酸蛋白(OT/BGP)ELISA Kit(武漢華美生物工程有限公司，貨號：CSB-E05129r)。

1.2 分組與干預

所有大鼠適應性喂養7 d后, 隨機分為空白組、模型組和中藥組, 每組10只。模型組和中藥組大鼠參考酒精性骨重構模型造模方法[14]采用20%(v∶v)酒精腹腔注射，10 mL/kg, 每日1次，共12周，復制酒精性骨損傷模型；正常組給予等體積生理鹽水腹腔注射。在造模開始第1天，中藥組在酒精造模基礎上給予接骨木提取物340 mg/kg，每日1次灌胃，共12周；空白組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

1.3 樣本采集及處理

大鼠稱重后禁食12 h，麻醉后心臟取血，3 000 r/min、4 ℃離心15 min后分離血清，-80 ℃恒溫冰箱保存備用。游離取股骨、椎體，剔除附著軟組織，根據不同檢測指標給予相應處置、備用。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 椎體HE染色

取動物新鮮組織塊投入固定液中使組織、細胞的蛋白質變性凝固；用不同梯度酒精作脫水劑，逐漸脫去組織塊中的水分；將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫，待石蠟完全浸入組織塊后進行包埋；將包埋好的蠟塊固定于切片機上，切成薄片，一般厚度為5～8 μm，貼到載玻片上，放45 ℃恒溫箱中烘干；用二甲苯脫去切片中的石蠟，再經不同濃度酒精洗脫，最后入蒸餾水；放入蘇木精-伊紅染色液染色數分鐘；經無水乙醇脫水，再經二甲苯使切片透明，封片。

1.4.2 qRT-PCR法檢測骨代謝標記基因表達

游離腰5椎體，剔除周圍軟組，預處理骨組織樣品[14]，注意樣品完整性。根據操作指南說明，使用TRIzol試劑(Invitrogen，CA，USA)提取骨組織樣品總RNA，并根據操作指南說明使用高效cDNA逆轉錄試劑盒制備cDNA。qRT-PCR在ABI 7900實時PCR系統上進行，條件如下：保持階段為95 ℃ 10 min，循環為40個循環，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s。檢查了以下基因的表達：I型膠原蛋白Alpha 2鏈(COL1A2，上游5′-AAGAATGCATACAGCCGTGC-3′，下游5′-ACTGCTCTGACCAATCCTTC-3′)，骨形態發生蛋白2(BMP2，上游5′-TGCGGTCTCCTAAAGGTCG-3′，下游5′-GGACTTAAGACGCTTCCGCT-3′)，骨γ-羧基谷氨酸蛋白(BGLAP，上游5′-TGCGGTCTCCTAAAGGTCG，GGACTTAAGACGCTTCCGCT-3′)，NF-κβ配體的受體激活劑(RANKL，上游5′-TGATGGAAGGTTCGTGGCTC-3′，下游5′-GGTACGCTCCCTGAGGTTTC-3′)，白介素6(IL-6，上游5′-CCAGTTGCCTTCTTGGGACT-3′，下游5′-TCTGACAGTGCATCATCGCT-3′)和骨保護素(OPG，上游5′-GGCACACGAGTGATGAATGC-3′，下游5′-TCTTCGCACAGGGTGACATC-3′)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，上游5′-GTGAAGGTCGGTGTGAACGG-3′，下游5′-CCCCATTTGATGTTAGCGGG-3′)基因的表達水平作為參考。每個基因qRT-PCR進行3次重復處理。隨后確定循環閾值(Ct)，并使用2-ΔΔCT方法比較計算mRNA表達的相對定量。

1.4.3 ELISA法檢測血清骨代謝標物IGF-1和Vitamin D以及骨穩態標物OCN和TRAP含量

按照對應試劑盒說明書對以上指標進行檢測。

1.4.4 Western blot法檢測凋亡標記基因表達

骨組織在RIPA裂解緩沖液中裂解，離心，用上樣緩沖液稀釋，95 ℃加熱6 min。使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。隨后，蛋白樣品通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并印跡到聚偏二氟乙烯膜上(Millipore，Billerica，MA，USA)。將膜在封閉液中封閉2 h，分別在Anti-Cleaved Caspase-3抗體、重組Anti-Caspase-3抗體、重組Anti-Bax抗體和Anti-beta Actin抗體稀釋液中4 ℃過夜。TBST洗滌3次，10 min/次，將膜與熒光基團偶聯的二抗在室溫下孵育1.5～2 h。熒光條帶通過奧德賽(Odyssey)雙色紅外熒光成像系統進行掃描并可視化定量分析。

2 結果

2.1 組織病理學結果

HE染色結果表明，模型組較空白組骨小梁數目、骨小梁連通度減少，髓腔脂肪細胞數目增加，提示酒精攝入可導致骨質減少；中藥組較模型組骨小梁數目、骨小梁連通度增加，髓腔脂肪細胞數目趨于正常水平，提示長期酒精攝入可導致大鼠骨質和骨量紊亂及髓脂代謝異常，接骨木提取物可在一定程度上拮抗酒精誘導的骨質和骨量代謝異常，可對酒精性骨重構起積極干預作用，見圖1。

注：A.空白組；B.模型組；C.中藥組。圖1 椎體HE染色(×50)

2.2 各組對骨重構標志物mRNA的影響

結果表明，與空白組比較，模型組骨形成相關基因BMP2、COL1A2和BGLAP mRNA 表達顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，提示長期酒精攝入對骨形成有顯著抑制作用；破骨活化相關基因RANKL和IL-6 mRNA表達顯著增加，而骨保護素OPG mRNA表達顯著降低，提示長期酒精攝入可激活破骨水平，增加骨質吸收，由此可見，酒精性骨重構表現為骨形成減少、骨吸收增加的骨穩態失衡。與模型組比較，中藥組骨形成相關基因BMP2、COL1A2和BGLAP mRNA表達顯著增加，差異具有統計學意義(P<0.05)，提示骨碎補提取物可在一定程度上拮抗酒精對骨形成有顯著抑制作用；破骨活化相關基因RANKL和IL-6 mRNA表達顯著降低，而骨保護素OPG mRNA表達顯著增加，提示骨碎補提取物可在一定程度上拮抗長期酒精攝入誘導破骨水平激活，抑制骨質吸收，由此可見，骨碎補提取物可在一定程度上恢復酒精性骨重構所致骨形成減少、骨吸收增加的骨穩態失衡，平調成骨/破骨動態水平，平衡骨質代謝，見表1。

表1 各組骨重構標志物mRNA表達水平情況

2.3 各組對血清骨代謝標物IGF-1和Vitamin D水平的影響

結果表明，與空白組比較，模型組血清骨代謝標物IGF-1含量顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，提示長期酒精攝入可使IGF-1含量降低，有礙骨質形成；與模型組比較，中藥組血清骨代謝標物IGF-1含量顯著增加(P<0.05)，提示骨碎補提取物可在一定程度上拮抗長期酒精攝入誘導的骨質形成紊亂。血清Vitamin D含量在各組間均無顯著差異，見表2。

表2 各組血清骨代謝標物IGF-1和Vitamin D水平

2.3 各組對血清骨穩態標物OCN和TRAP含量的影響

結果表明，與空白組比較，模型組血清骨穩態標物TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase 5)(骨吸收標記物)含量顯著增加，差異具有統計學意義(P<0.05)，提示長期酒精攝入可破壞骨穩態失衡，有利骨質吸收；與模型組比較，中藥組血清骨穩態標物TRAP含量顯著減少(P<0.05)，提示骨碎補提取物可在一定程度上拮抗長期酒精攝入誘導的骨質吸收紊亂。血清OCN(骨形成標記物)含量在各組間均無顯著差異，見表3。

表3 各組血清骨穩態標物OCN和TRAP含量

2.4 各組對CASP3、BAX凋亡相關蛋白表達的影響

結果表明，與空白組比較，模型組凋亡相關蛋白Cl-CASP3(CASP3活化形式)、BAX表達顯著增加，差異具有統計學意義(P<0.05)，提示長期酒精攝入可增加細胞凋亡水平，誘導骨重構紊亂與細胞凋亡密切相關。與模型組比較，中藥組凋亡相關蛋白Cl-CASP3(CASP3活化形式)、BAX表達顯著降低，提示骨碎補提取物可在一定程度上拮抗酒精誘導的凋亡活化，見表4、圖2。

表4 各組CASP3、BAX凋亡相關蛋白表達情況

圖2 各組CASP3、BAX凋亡相關蛋白表達情況

3 討論

酒精性骨重構(又稱酒精性骨重建、酒精性骨重造、酒精性骨重塑、酒精性骨減少等)是以全身骨質和骨量異常為特征[1]，是酒精誘導骨組織細胞異常代謝而導致骨穩態失衡的綜合反映(本研究中，酒精誘導的骨代謝紊亂及微觀結構異常可見圖1和表1、2等)，其最終表現為骨髓間充質干細胞、成骨細胞、破骨細胞、骨細胞活性和功能異常，破壞了成骨/破骨生理平衡，是酒精性骨壞死、酒精性骨質疏松癥[5]等的共同病理過程。本研究結果表明，骨碎補提取物可在一定程度上拮抗長期酒精攝入誘導破骨水平激活，抑制骨質吸收，一定程度上恢復酒精性骨重構所致骨形成減少、骨吸收增加的骨穩態失衡，平調成骨/破骨動態水平，平衡骨質代謝(見圖1和表1等)。前期動物和細胞實驗結果表明，酒精對骨重構的影響是多維態的，既可表現為骨微觀形態結構異常、骨生物力學性能降低、機體代謝紊亂、氧化 還原失衡和破骨細胞異常活化，又可表現為酒精介導的骨髓間充質干細胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)形態異常、氧化應激增高、自噬改變、凋亡亢進[15]和成骨分化紊亂等[4]。中藥單體丹酚酸B可能主要通過調節酒精介導的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)增高來緩解BMSCs凋亡，增加細胞活力和促進細胞存活，柚皮苷對BMSCs活力作用不如丹酚酸B顯著;柚皮苷可能主要通過促進BMSCs 成骨分化來干預酒精對骨形成的抑制作用，丹酚酸B對酒精性成骨分化抑制亦有一定改善作用，但不如柚皮苷顯著，且丹酚酸B對成脂分化的抑制作用亦較柚皮苷弱[4]。補腎活血法可作為防治酒精性骨病的方法之一[6,16]。酒精對骨重構的影響是多維態的，抗氧化、抗凋亡和調節成骨/成脂骨穩態可能是干預酒精性骨重構的有效靶點[3-4]。

接骨木含有粗脂肪、粗蛋白、粗纖維、總糖等主要營養成分和鉀、鈉、鈣、鎂、鐵等礦質元素以及氨基酸等，營養豐富,各種營養成分較為全面。前期實驗我們已經確定了接骨木根皮促進骨折愈合的有效部位及可能活性組分[17]。(7R,8S)-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-[4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphe-noxy]-1,3-propanediol (PPD)是一種從接骨木分離鑒定的具有骨保護作用的化合物，可以在大鼠類成骨UMR 106細胞、前成骨MC3T3-E1細胞以及BMSC細胞的成骨過程的不同階段發揮類雌激素活性，從而刺激成骨細胞功能。進一步研究表明，PPD可能通過ER配體非依賴性方式激活ERK / MAPK信號通路而在UMR 106細胞中發揮其雌激素作用。淫羊藿苷也曾報道過類似的作用方式調節UMR 106細胞[18]、MC3T3-E1細胞[19]和骨細胞[20]成骨分化。木質素類為接骨木主要組分之一。一些研究報告了木脂素在體內和體外對骨骼的有益作用。從杜仲中提取的總木脂素有效地抑制了卵巢切除術(OVX)誘導的骨質流失，并促進了原代成骨細胞的增殖，分化和骨蛋白原(OPG)表達[21]。芝麻中的主要木脂素芝麻素通過加速成骨細胞基因的表達來刺激成骨細胞成熟而發揮功能[22]。北五味子果實和種子中的木質素增加成骨細胞中堿性磷酸酶的活性[23]。盡管已經證明了一些木脂素對骨骼的合成代謝作用，但兩項臨床研究表明，亞麻籽中的木脂素在防止更年期婦女骨質流失方面并不有效[24-25]。關于木脂素對酒精性骨骼損傷的作用的報道相對有限，并且亞麻籽中木脂素對骨骼缺乏保護作用可能是由于所使用的木脂素的化學結構不同所致。因此，為了系統地評估木脂素對骨骼的保護作用，并解析接骨木骨骼保護作用的機制需要進一步的實驗和臨床研究。本研究證實，接骨木提取物對酒精性骨病有積極干預作用，其干預直接可能通過改善骨質代謝、恢復骨穩態和拮抗酒精誘導的細胞凋亡機制有關。

本研究HE染色結果提示長期酒精攝入可導致大鼠骨質和骨量紊亂及髓脂代謝異常，接骨木提取物可在一定程度上拮抗酒精誘導的骨質和骨量代謝異常，可對酒精性骨重構起積極干預作用。骨重構標志物mRNA分析結果表明，長期酒精攝入對骨形成有顯著抑制作用，卻可激活破骨水平，增加骨質吸收，由此可見，酒精性骨重構表現為骨形成減少、骨吸收增加的骨穩態失衡；骨碎補提取物可在一定程度上拮抗長期酒精攝入誘導破骨水平激活，抑制骨質吸收，一定程度上恢復酒精性骨重構所致骨形成減少、骨吸收增加的骨穩態失衡，平調成骨/破骨動態水平，平衡骨質代謝。IGF-1是一種參與骨骼生長和骨骼合成的關鍵激素，在酒精性骨重構發生發展中起重要作用[26]。本研究表明乙醇處理引起了血清IGF-1水平的降低，提示骨合成代謝紊亂。Vitamin D作為參與骨結構和骨代謝的重要物質[27]，本研究中未觀察到酒精攝入導致血清Vitamin D水平顯著變化。骨鈣素是骨合成的標志物，是成骨細胞分泌的高度豐富的骨蛋白，調節骨骼的重塑和能量代謝，其編碼的蛋白質包含一個Gla(γ羧基谷氨酸)結構域，該結構域可與鈣和骨骼的礦物質羥磷灰石結合。本研究中未觀察到酒精攝入導致血清骨鈣素水平顯著變化。甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)能刺激破骨細胞分泌TRAP；甲狀旁腺激素是甲狀旁腺主細胞分泌的堿性單鏈多肽類激素，主要靶向骨和腎臟來調節體內鈣和磷的代謝，促使血鈣水平升高，血磷水平下降，在骨穩態維持中起重要作用。結果表明，長期酒精攝入可增加TRAP水平，有利骨質吸收；骨碎補提取物可在一定程度上拮抗長期酒精攝入誘導的骨質吸收紊亂。Cl-CASP3(Cleaved caspase-3，為caspase-3活化形式)作為調控細胞凋亡的關鍵效應分子。酒精增加Cl-CASP3表達，誘導細胞凋亡，研究表明骨組織活化的caspase-3含量與骨密度呈負相關[15]，接骨木可能通過拮抗酒精誘導的細胞凋亡來干預酒精性骨重構的發生發展。

本研究表明，接骨木提取物可能是通過拮抗酒精誘導的細胞凋亡亢進、增加血清IGF-1水平和降低TRAP含量，增加骨小梁數目，來恢復酒精性骨穩態失衡，促進骨質形成而抑制骨質吸收，恢復正常骨代謝和維持正常骨穩態以減緩酒精對骨質和骨量的毒副作用，同時為臨床防治酒精性骨病提供了參考和依據。