蓬子菜總黃酮對D-半乳糖致過氧化損傷大鼠SOD、MDA和GSH-Px水平的影響

崔明宇，尹義鳳，朱鳳梅，隋玥，閻雪瑩

(黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

蓬子菜(GaliumverumL.)為茜草科拉拉藤屬植物，臨床多用于周圍血管病的治療[1-2]。蓬子菜含多種結構類型的化學成分，其中主要活性成分總黃酮(FVGL)能夠保護被H2O2損傷的臍靜脈內皮細胞[3]，改善四氯化碳所致急性肝損傷[4]，對缺氧/復氧誘導的心肌微血管內皮細胞損傷亦具有保護作用[5]。1956年Denham Harman提出的自由基老化理論認為年齡相關性疾病的主要因素是氧化損傷[6]，如呼吸、動脈粥樣硬化、心腦血管疾病以及各種癌癥，但FVGL對衰老所致氧化損傷的影響尚不清楚。D-半乳糖正常情況下于肝臟中代謝為葡萄糖，較高濃度時則使衰老細胞數目增加，促進機體活性氧形成，降低抗氧化酶活性，從而加速衰老進程，是國內外研究衰老及氧化損傷機制公認的造模方法[7-8]。因此本研究采用D-半乳糖致氧化損傷大鼠模擬衰老模型，考察FVGL對過氧化損傷大鼠體內的抗氧化相關指標水平的影響，探究其抗氧化損傷的作用機制，為蓬子菜開發成臨床治療衰老相關疾病的新藥提供依據。

1 材料

1.1 儀器

BT25S型分析天平(德國Sartorius公司)；Allegra64R型低溫高速離心機(BeckMan coulter公司)；HHS型恒溫水浴鍋(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；XW-80A型渦旋混合器(上海醫用儀器廠)；T10型組織勻漿機(Sigma公司)；Multiskan GO 1510型全波長酶標儀(Thermo Fisher公司)。

1.2 藥品與試劑

D-半乳糖(Biotopped公司，批號：20151201)；維生素E(上海源葉生物科技有限公司，批號：20150807)；蓬子菜總黃酮(含量>58%，實驗室自制)；超氧化酶歧化物(T-SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20170521)；丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20170611)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20170526)。

1.3 動物

SD雄性大鼠，體質量(220±20)g，青島市實驗動物中心，合格證號：SCXK(魯)2014-004。實驗室環境溫度(22±2)℃，相對濕度(50±10)%。

2 方法

2.1 過氧化損傷模型的建立

60只SD大鼠自由進食飲水適應性喂養1周后，隨機分為空白組及模型組，空白組腹腔注射7.5 mL/kg的注射用水，模型組腹腔注射20 mg/mL的D-半乳糖溶液，劑量為150 mg/kg，每日1次，6周后，眼眶后靜脈叢取血測定MDA值，確定過氧化損傷模型的建立。

2.2 分組及給藥

將造模成功的過氧化損傷大鼠根據MDA水平隨機分為模型組，VE陽性組(100 mg/kg VE)及FVGL低、中、高劑量組(45 mg/kg、90 mg/kg、180 mg/kg)，除空白組及模型組灌胃給予生理鹽水外，其余各組分別灌胃相應藥物，給藥期間繼續腹腔注射D-半乳糖溶液。

2.3 體質量及臟器系數的測定

實驗期間記錄大鼠每周體質量情況，連續給藥14 d后，禁食不禁水12 h，經眼眶后靜脈叢取血后，將大鼠脫頸處死，取其肝、脾、心、腎和腦組織，用冰生理鹽水沖洗臟器上的血液，濾紙吸干表面水分后稱重。

大鼠的臟器系數(g/100 g)=臟器質量(g)/大鼠的體質量(g)×100

2.4 血漿和組織樣品的制備

血漿：血液于4 000 r/min下離心10 min，吸取上清液分裝，凍存于-80 ℃冰箱中，備后續生化檢測。

10%組織勻漿：取各組大鼠肝臟和腦組織，以重量∶體積為1∶9的比例加入帶冰的生理鹽水中，采用組織勻漿機研磨各臟器組織，勻漿后的組織液于4 000 r/min離心10 min，收集上清液進行分裝，凍存于-80 ℃冰箱中，備后續生化檢測。

2.5 抗氧化作用相關指標的測定

采用試劑盒分別測定大鼠血漿、肝臟、腦組織中總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的水平，考察不同劑量FVGL對不同組織內抗氧化作用相關指標的影響。

2.6 統計分析

3 結果

3.1 FGVL對大鼠日常狀態的影響

空白組大鼠精神狀態良好，飲食正常，行動敏捷，皮毛和膚色有光澤；模型組大鼠與空白組相比精神萎靡，毛色黯淡無光，毛發稀疏易于脫落，尾根部出現白斑，倦怠蜷臥，反應遲鈍，出現簇擁扎堆等現象。給藥組大鼠日常狀態均有所好轉且優于模型組，蓬子菜中、高劑量組大鼠狀態接近空白組。

3.2 FGVL對大鼠體質量的影響

實驗前大鼠平均體質量大致相同，組間無顯著差異(P>0.05)。造模及給藥期間，各組大鼠體質量呈逐漸上升趨勢，排便量增加，而FVGL各給藥組大鼠較其他組體質量增長較緩慢，但無顯著差異(P>0.05)。說明FVGL對大鼠的體質量變化無顯著影響，見表1。

表1 不同給藥組大鼠的體質量變化情況

3.3 FGVL對過氧化損傷大鼠臟器系數的影響

各組大鼠臟器色澤鮮艷，對其臟器系數進行測定，結果表明，過氧化損傷大鼠與空白組大鼠相比心臟質量較小，給藥后，VE陽性組及FVGL各劑量組與模型組相比均提高，但無統計學意義(P>0.05)，說明此劑量D-半乳糖對大鼠心臟損傷不大，且灌胃給予FVGL能夠加以改善。而模型組大鼠肝、脾、腎等臟器質量與空白組相比明顯降低，大腦嚴重萎縮，給藥后，FVGL低、中、高劑量組和VE陽性組大鼠臟器已基本恢復到正常水平，同時大腦萎縮現象得以改善，與空白組相比無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 FGVL對過氧化損傷大鼠臟器指數的影響

3.4 FGVL對大鼠血漿和臟器中GSH-Px水平的影響

與空白組相比，模型組血漿、肝臟、腦組織中的GSH-Px水平明顯下降(P<0.05)。灌胃給予FVGL后，低、中、高劑量組和VE陽性組均可提高大鼠GSH-Px水平，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 FGVL對過氧化損傷大鼠血漿及臟器內GSH-Px水平的影響

3.5 FGVL對大鼠血漿和臟器組織中T-SOD水平的影響

由表4可知，D-半乳糖連續注射一段時間后，大鼠的血漿、肝臟、腦組織中T-SOD水平下降，FGVL低劑量組灌胃后血漿中T-SOD水平增加，但無明顯差異，而中、高劑量組和VE陽性組可顯著提高T-SOD水平，差異具有顯著性(P<0.05)。除FVGL中劑量組外，低、高劑量組和VE陽性組均可顯著提高大鼠肝臟中T-SOD水平，且與模型組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)，而對提高腦組織中T-SOD水平，差異無統計學意義(P>0.05)。

表4 FGVL對過氧化損傷大鼠血漿及臟器內T-SOD水平的影響

3.6 FGVL對大鼠血漿和臟器組織中MDA水平的影響

與空白組相比，模型組血漿、肝臟、腦組織中的MDA含量明顯升高(P<0.05)。除 FGVL低劑量組外，各給藥組均能不同程度降低血漿、肝臟、腦組織中MDA含量，且與模型組比較具有顯著差異(P<0.05)，見表5。

表5 FGVL對D-半乳糖致過氧化損傷大鼠血漿及臟器內MDA水平的影響

4 討論

機體通過酶系統與非酶系統產生能夠攻擊生物膜中多數不飽和脂肪酸的超氧化物，進一步引發脂質過氧化，形成脂質過氧化物(LOOH)，如醛基(丙二醛MDA)、酮基、羥基、羧基等，對細胞膜進行攻擊并破壞。因此，MDA含量的高低間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。而總超氧化物歧化酶(T-SOD)能夠將超氧化物轉化為過氧化氫，進而由過氧化氫酶或谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)轉化為水。此外，GSH-Px能夠使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，并特異性地將還原型谷胱甘肽(GSH)轉化為氧化型谷胱甘肽(GSSG)(見圖1)，在保護細胞膜結構和功能的完整性中起重要作用[9]。T-SOD和GSH-Px的含量能夠反映機體清除氧自由基的能力，通常被認為是考察機體抗氧化防御系統能力的指標[10]。因此，測定過氧化損傷大鼠血漿及臟器組織中MDA、T-SOD及GSH-Px的水平對于考察FVGL的抗氧化損傷作用具有重要意義。

圖1 FVGL抗氧化損傷機制

本研究造模及給藥過程中，各組大鼠心臟質量與模型組大鼠差異不大，FVGL各劑量組和模型組較空白組大鼠心臟質量小，陽性對照組及FVGL各劑量組與模型組相比均提高3.39%。說明此劑量(150 mg/kg)的D-半乳糖對大鼠心臟損傷不大[11]，且灌胃給予FVGL對大鼠的心臟沒有損傷。

目前研究表明，人類衰老是一個氧化損傷的過程，而很多疾病與氧化損傷相關，因此抗氧化損傷藥物對衰老相關疾病的預防及治療具有重要意義。本研究通過腹腔注射D-半乳糖建立大鼠過氧化損傷模型，以不同濃度FVGL給藥，探討其對過氧化損傷大鼠體內抗氧化水平的影響。實驗結果表明，FVGL各劑量組和VE組能夠減輕過氧化損傷大鼠的衰老癥狀，且對過氧化損傷大鼠的肝、脾、腎和腦組織受損有一定的改善作用，增加臟器指數。同時，FVGL三個劑量組均能不同程度使血漿，肝臟，大腦組織中T-SOD、GSH-Px水平升高，MDA水平降低。因此，FVGL能夠提高大鼠抗氧化能力，改善組織器官的氧化損傷，延緩機體衰老。

綜上所述，蓬子菜作為藥食同源植物，可預防機體早衰，對動脈粥樣硬化[12]、血栓、心腦血管[13]等慢性疾病的預防與治療具有重要意義及開發前景。