扶正消巖湯對乳腺癌腫瘤微環境調控機制的研究

馮月男，孫思邈，孔祥定,2，肖洪彬，王寬宇,2*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

乳腺癌是目前世界上最常見的女性惡性腫瘤，其發病率為女性腫瘤的第一名并呈現出年輕化的趨勢，它的發生受遺傳、環境等多種因素影響。近年來，乳腺癌的相關研究發現，MicroRNA(miRNA)通過調控機體內的抑癌基因作為“腫瘤抑制因子”發揮作用，也可以通過調控機體內的促癌基因作為“腫瘤激活因子”而發揮作用，調節機體內相關信號通路進而在不同類型乳腺癌的發生發展中起關鍵作用[1-2]。

巨噬細胞是一類在全身血液系統及組織中廣泛存在的免疫細胞，能夠分泌多種活性因子來發揮免疫調節及免疫效應作用。同時，巨噬細胞又是腫瘤微環境(TAMs)中重要的且數量最多的炎癥細胞，巨噬細胞浸潤到腫瘤組織后，不同條件下可分化為抗腫瘤的M1型和促腫瘤M2型[3]。各種研究表明，腫瘤微環境中TAMs主要向M2型巨噬細胞極化，并促使腫瘤向惡性腫瘤進展[4]。因此，逆轉TAMs表型由促腫瘤M2表型向抗腫瘤M1表型分化；減弱TAMs對腫瘤的促進作用在乳腺癌中的做進一步探索具有一定價值。扶正消巖湯是黑龍江中醫藥大學外科主任王寬宇教授的臨床經驗方，研究表明該方治療乳腺癌有效，且前期實驗證明了扶正消巖湯能提高乳腺癌荷瘤小鼠的免疫功能、調控炎癥因子表達，并且能夠抑制小鼠體內瘤體增長、有效減緩小鼠體質量下降[5-6]。本研究從扶正消巖湯對腫瘤微環境中M1和M2型巨噬細胞標志因子出發，探討其對腫瘤微環境的調控作用。

1 實驗材料

1.1 細胞

乳腺癌4T1細胞株和人單核細胞系THP-1均購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 實驗動物

SPF級健康SD大鼠24只，雌雄各半，體質量180～220 g，大鼠購于遼寧長生生物技術有限公司，許可證號：SCXK(遼)2020-0001，實驗單位使用許可證號：SYXK(黑)2016-004，動物的飼養和使用符合國際動物倫理法。

1.3 藥物

扶正消巖湯組成：黨參20 g，半枝蓮20 g，白術15 g，當歸15 g，陳皮15 g，枸杞子15 g，山萸肉15 g，女貞子15 g，半夏10 g，莪術5 g，白芍10 g，茯苓10 g，上述中藥飲片購于黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，均符合《中華人民共和國藥典》(2015年版)要求；環磷酰胺(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，國藥準字：H32020857，生產批號：18050825)。

1.4 主要儀器

CO2恒溫培養箱(SHEL LAB，型號：SCO6WE)；潔凈工作臺(蘇凈安泰，型號：SW-CJ-1FD)；倒置顯微鏡(OLYMPUS，型號：Ⅸ51)；酶標儀(Diatek，型號：DR-200Bs)；臺式離心機(上海安亭科學儀器廠，型號：TGL-16c)；冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器，型號：H-2050R)；制冰機(常熟市雪科電器有限公司，型號：IMS-20)；水浴鍋(金壇市江南儀器廠，型號：HH-W-600)。

1.5 試劑及耗材

胎牛血清(Gibco，批號：A3160802)；RPMI-1640培養基(Procell，批號：PM150110)；胰酶-EDTA(吉諾生物醫藥技術有限公司，批號：GNM25200 )PBS溶液 (ASPEN，批號：AS1044 )；Mouse CD86分子(CD86)試劑盒(上海朗頓生物，批號：BPE20930 )；Mouse CD163分子(CD163)試劑盒(上海朗頓生物，批號：BPE20991)；Mouse白細胞介素 1β(IL-1β)試劑盒(上海朗頓生物，批號：BPE20013)；Mouse 白細胞介素 10(IL-10)試劑盒(上海朗頓生物，批號：BPE20005)；Mouse白細胞介素12(IL-12 p70)試劑盒(上海朗頓生物 ，批號：BPE20750)；Mouse 血管內皮生長因子(VEGF)試劑盒(上海朗頓生物，批號：BPE20450)；Mouse Caspase3試劑盒(上海朗頓生物，批號：BPE20250)；Mouse Caspase9試劑盒(上海朗頓生物，批號：BPE20234)；Mouse Bcl2試劑盒(上海朗頓生物，批號：BPE20227)；Mouse NF-κB試劑盒(上海朗頓生物，批號：BPE20817)。

2 實驗方法

2.1 乳腺癌4T1細胞和單核細胞系THP-1細胞培養

細胞置于含1%青鏈霉素、10%胎牛血清的1640培養基、37 ℃ 5% CO2恒溫培養箱中培養，倒置顯微鏡下觀察細胞生長貼壁情況，選取對數生長期的細胞進行后續實驗。

2.2 M2巨噬細胞的誘導

THP-1細胞置于含20 ng/mL的IL-4和20 ng/mL的IL-13的培養液中在37 ℃、5% CO2的條件下培養48 h，即為極化型M2巨噬細胞。

2.3 M2型乳腺癌細胞培養

將2.2中獲得的M2型THP-1細胞上清液與4T1細胞共培養72 h，用于后續實驗。

2.4 含藥血清制備

24只大鼠隨機分為生理鹽水組、扶正消巖湯高、中、低劑量灌胃組，每組6只，生理鹽水組按照1 mL/100 g灌胃給藥、給藥組按照高、中、低分別為20、10、5 g/kg生藥按照1 mL/100 g灌胃給藥。每日灌胃給藥2次，連續7 d，于末次給藥1.5 h后，戊巴比妥麻醉，于腹主動脈采血，置于含有枸櫞酸鈉的離心管中，以3 000 r/min離心15 min，取血漿，于56 ℃水浴條件下滅活30 min，過0.22 μm微孔濾膜除菌后，于-80 ℃下保存，備用。

2.5 扶正消巖湯給藥濃度及作用時間的篩選

M2型乳腺癌4T1細胞接種于96孔板中，每孔100 μL，24 h后細胞貼壁，給藥組給予帶有含藥血清的培養液，每組設8個復孔，繼續培養24 h和48 h后棄培養液，按試劑盒說明加CCK8試劑，置孵箱內過夜，酶標儀測定490 nm波長處吸光度值，扶正消巖湯高劑量作用細胞48 h抑制細胞增殖效果最佳，故選擇此條件用于后續實驗。

2.6 細胞轉染

將培養的對數生長期M2型乳腺癌4T1細胞依據不同轉染操作和不同實驗目的分為空白組、NC組(陰性對照組，只加入轉染試劑)、扶正消巖湯組及miR-146a mimic、miR-146a mimic+中藥組。miR-146a組轉染miR-146a mimic模擬物，NC組轉染miR-NC，空白組不做干預，轉染成功即進行后續實驗。

2.7 CCK8法檢測miR-146a轉染對細胞增殖的影響

測miR-146a對4T1細胞增殖活性的影響。取“2.4”項下轉染細胞懸液適量100 μL/孔傳至96孔板，24 h后細胞貼壁，換培養液，除空白組及中藥組外均加入miR-146a mimic，終濃度20 nmol/L，設8個復孔，繼續培養48 h后按照CCK8試劑盒說明書操作，測定490 nm波長吸光度值。

2.8 ELISA法檢測扶正消巖湯對轉染miR-146a4T1細胞上清液中M1、M2特異蛋白IL10、IL12、CD86、CD163的影響

采用ELISA法進行檢測。取“2.4”項下轉染細胞懸液適量，按照相應ELISA試劑盒說明書方法操作后，采用酶標儀于490 nm波長下檢測各組細胞上清液中細胞因子的含量。以上試驗重復3次。

2.9 ELISA法檢測扶正消巖湯對轉染miR-146a 4T1細胞上清液中TNF-α、IL-1β、NF-κB、RAF-6、IRAK-1的影響

方法同2.8。

2.10 統計學方法

3 實驗結果

3.1 扶正消巖湯+miR146a過表達對乳腺癌4T1細胞48 h細胞增殖的影響

由表1可知，與空白組比較，NC組對乳腺癌4T1細胞48h細胞增殖無影響(P>0.05)，扶正消巖湯組、miR-146a mimic組、miR-146α mimic+扶正消巖湯組對乳腺癌4T1細胞48 h細胞增殖有顯著抑制作用(P<0.01)。

表1 扶正消巖湯+miR146a過表達對乳腺癌4T1細胞48h細胞增殖的影響

3.2 ELISA法檢測細胞中IL10、IL12、CD86、CD163的含量

由表2可知，與空白組比較，NC組對乳腺癌4T1細胞上清液中IL10、IL12、CD86、CD163含量無明顯影響(P>0.05)，扶正消巖湯組、miR-146a mimic組、miR-146a mimic+扶正消巖湯組能顯著降低IL10、CD163含量(P<0.01)，顯著升高IL12、CD86含量(P<0.01)。

表2 扶正消巖湯+miR146a過表達對乳腺癌4T1細胞中IL10、IL12、CD86、CD163含量的影響

3.3 ELISA法測細胞上清液中Caspase3、Caspase9含量

由表3可知，與空白組比較，NC組中乳腺癌4T1細胞上清液中Caspase3、Caspase9含量無明顯影響(P>0.05)，miR-146a mimic組、扶正消巖湯組、miR-146a mimic+扶正消巖湯組能顯著升高Caspase3、Caspase9含量(P<0.05，P<0.01)。

表3 扶正消巖湯+miR146a過表達對乳腺癌4T1細胞中Caspase3、Caspase9含量的影響

3.4 ELISA法測細胞上清液中TNF-α、IL-1β、NF-κB、RAF-6、IRAK-1含量

由表4、表5可知，與空白組比較，NC組對乳腺癌4T1細胞上清液中TNF-α、IL-1β、NF-κB、RAF-6、IRAK-1含量無明顯影響(P>0.05)，扶正消巖湯組、miR-146a mimic組、miR-146a mimic+扶正消巖湯組能顯著降低TNF-α、IL-1β、NF-κB、RAF-6、IRAK-1含量(P<0.05，P<0.01)。

表4 扶正消巖湯+miR146a過表達對乳腺癌4T1細胞中TNF-α、IL-1β含量的影響

表5 扶正消巖湯+miR146a過表達對乳腺癌4T1細胞中RAF-6、IRAK-1、NF-κB含量的影響

4 討論

扶正消巖湯由12味中藥組成，其中黨參和半枝蓮為君藥，黨參能補中益氣、健脾益肺，半枝蓮能清熱解毒、散瘀消腫，二者配伍起到扶正祛邪的雙重功效；臣藥白芍配白術能夠提升正氣、益氣健脾，當歸活血化瘀、補血行氣，增強君藥扶正祛邪的功效；再臣以莪術、半夏和陳皮用于消積、行氣、止痛，女貞子、山茱萸、 枸杞滋陰補腎，以上6味藥共同增強君藥扶正的功效；茯苓作為佐藥具有利水消腫的作用，同時能夠增強白術益氣健脾的功效，起到提高免疫功效，諸藥共奏扶正消巖之功[6]。

核轉錄因子(NF-κB)為一個轉錄因子蛋白家族，它可以調控包括IL-1β、IL-6、IL- 12、TNF-α、黏附分子等在內的許多分子，在各階段炎癥反應及在腫瘤發生發展過程中起著重要的調控作用[7-8]。同時，NF-κB信號通路可以通過蛋白質的生成來調控microRNA(miRNA)的水平，參與機體各種生理、病理過程。miR-146a是一個典型的多功能miRNA[9-11]，miR 146a在炎癥因子的刺激下有著高反應性，有研究報道，在TNF-α、IL-1β的刺激下，機體可通過NF-κB通路上調miR-146a的表達，而白介素1受體相關激酶(IRAK-1)和腫瘤壞死因子相關手提因子(RAF-6)是miR-146a的直接靶分子，miR-146a通過與IRAK-1和RAF-6二者的特定區域結合轉錄后抑制二者的表達，負性調節NF-κB的激活，及下游細胞因子TNF-α和IL-1β等的表達[12]。miR-146a過表達后，IRAK-1和RAF-6的表達水平降低，是的NF-κB通路受到抑制，從而降低機體的炎癥反應。本研究顯示，用miR-146a-5p模擬物轉染后，上調miR-146a-5p的表達，在降低了IRAK-1和RAF-6蛋白表達的同時抑制了NF-κB的激活。與先前[9]的研究一致：miR-146a可通過抑制IRAK1/TRAF6/NF-κB通路來下調乳腺癌中IL-1β和TNF-α的產生。

巨噬細胞M1型和M2間的平衡是維持機體平衡和調控炎癥反應所必需的[13]。研究發現，M1型巨噬細胞通過高表達IL-12、CD86、低表達IL-10、參與炎癥反應來抑制腫瘤的發展，M2型巨噬細胞通過高表達IL-10、CD163、低表達IL-12，促進免疫耐受[14-16]，促進腫瘤發展。在腫瘤微環境中，TAMs主要向M2型巨噬細胞極化促使腫瘤向惡性腫瘤進展。TAMs在乳腺癌中的作用還需要進一步探索，其可能成為乳腺癌潛在的治療靶點。本實驗通過細胞轉染法上調乳腺癌4T1細胞中miR146a的表達，發現miR146a過表達+扶正消巖湯組可顯著升高IL12、CD86含量、降低IL10、CD163含量的同時促進促凋亡蛋白Caspase3、Caspase9的表達、下調TNF-α、IL-1β、NF-κB、RAF-6、IRAK-1的表達，說明扶正消巖湯逆轉腫瘤由M2期向M1期的轉變從而抑制乳腺癌惡化進展的作用機制可能是通過上調miR146a表達從而抑制NF-κB通路中TNF-α、IL-1β、NF-κB、RAF-6、IRAK-1因子的作用，激活促凋亡因子Caspase3、Caspase9的表達來調控乳腺癌的發展。本實驗的完成為接下來課題組深入研究扶正消巖湯抗乳腺癌的分子機制提供實驗支持。