黃芪甲苷通過NRF2/HO-1信號通路減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷*

李澤華， 關賢頌， 蔣路平

（長沙市中心醫院心血管內科，湖南長沙410004）

心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷是指心肌缺血后重新恢復血流灌注出現心肌損傷反而加重的現象［1］。隨著經皮冠狀動脈介入、溶栓治療等技術的應用推廣，心肌I/R 損傷逐漸成為臨床面臨的主要難題［2］。研究表明，氧化應激、鈣超載和線粒體功能障礙等在心肌I/R 損傷中發揮重要作用［3-5］，其中氧化應激能激活促炎級聯反應，導致心肌細胞凋亡，誘發心肌損傷［6］。因此，減輕心肌細胞氧化應激反應是減輕心肌I/R損傷的可能途徑。

黃芪是豆科植物蒙古黃芪的干燥根，具有補氣固表，托瘡生肌之功效［7］，臨床上常用于冠心病、高血壓和糖尿病等疾病的輔助治療［8］。研究表明，黃芪的主要有效成分黃芪甲苷（astragaloside IV，AST）能減少活性氧的釋放，保護心肌細胞免受氧化應激損傷［9］。此外，黃芪甲苷還能抑制鈣超載，減少心肌細胞凋亡，抑制心肌肥厚、心肌纖維化［10-11］，提示黃芪甲苷在心肌損傷中發揮重要的保護作用。但黃芪甲苷在心肌I/R 損傷中發揮的作用及機制尚不完全清楚。本研究首先采用C57BL/6 小鼠建立心肌I/R 損傷模型，在整體動物水平驗證黃芪甲苷對小鼠的心肌保護作用；其次，采用過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）處理H9C2 細胞，在細胞水平研究黃芪甲苷通過NRF2/HO-1信號通路影響細胞損傷的分子機制。

材料和方法

1 實驗動物和細胞

60 只 SPF 級 6～8 周齡 C57BL/6 雄性小鼠，18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物使用許可證號為SYXK（湘）2020-0017。大鼠心肌H9C2細胞購自于美國標準生物品收藏中心。

2 主要試劑

黃芪甲苷（Selleck）；H2O2（Sigma）；Lipofectamine 2000（Thermo Fisher）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB）檢測試劑盒（南京建成有限公司）；caspase-3 活性檢測試劑盒（碧云天公司）；cleaved caspase-3、核因子 E2 相關因子 2（nuclear factor E2-related factor 2，NRF2）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）和 β-actin 抗體及 HRP 標記的山羊抗兔IgG（Abcam）。

3 主要方法

3.1 小鼠心肌I/R 損傷模型 心肌I/R 損傷小鼠造模方法根據文獻［12］所述：C57BL/6 異氟烷吸入麻醉，仰臥固定于實驗臺，連接心電圖，行氣管插管術后連接小動物呼吸機。沿第3、4 肋間打開胸腔，剔除心包膜，結扎左冠狀動脈前降支，觀察小鼠心電圖變化，以ST 段抬高作為判斷結扎成功的標準。結扎30 min 后松開結扎點，恢復心肌血流供應。再灌注24 h后進行血流動力學指標測定和標本收集。

3.2 小鼠分組與給藥 60 只C57BL/6 小鼠隨機分成假手術（sham）組、模型（I/R）組與黃芪甲苷（I/R+AST）組，每組20只。sham組小鼠開胸后不結扎左冠狀動脈前降支，I/R 組和I/R+AST 組小鼠制備心肌I/R損傷模型，I/R+AST 組在結扎30 min 后腹腔注射20 mg/kg黃芪甲苷［13］，I/R組注射等體積生理鹽水。

3.3 小鼠心肌血流動力學指標測定 再灌注24 h后測定血流動力學指標，小鼠異氟烷吸入麻醉，采用Powerlab 生理記錄儀檢測小鼠左室壓力下降最大速率（-dp/dtmax）和左室壓力上升最大速率（+dp/dtmax）。

3.4 血清CK-MB 水平測定 再灌注24 h 后收集小鼠血液標本，室溫靜置 30 min，4 ℃、500×g離心 15 min，免疫抑制法檢測血清中CK-MB 水平，具體操作按照試劑盒說明書進行。

3.5 細胞處理前準備 分別采用不同濃度（0.25、0.5、0.75 和 1 mmol/L）的 H2O2和不同濃度（25、50 和100 μmol/L）的AST［13］處理H9C2細胞，以明確最終實驗分組處理的劑量。

3.6 siRNA 轉染 轉染前 24 h 鋪板，H9C2C 細胞按照每孔5×105的密度接種于6 孔板中，當細胞生長至50%時，依照Lipofectamine 2000 說明制備的siRNALipofectamine 2000復合物加入6孔板，培養箱內常規孵育6 h，更換為新培養基繼續培養48 h 用于后續實驗。siRNA 由上海吉瑪公司合成：scrambled siRNA的序列為 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；NRF2siRNA 的序列為 5′-GUCAGCGACAGAAGGAUUATT-3′；HO-1siRNA 的 序 列 為 5′-GGAAAAUCCCAGAUCAGCATT-3′。

3.7 細胞實驗分組和處理 細胞實驗分為兩個部分：（1）對照（control）組（常規培養）、模型組（H2O2組，H2O2處理）和H2O2+AST組（H2O2處理+AST處理）；（2）scrambled siRNA 組（scrambled siRNA 轉染）、scrambled siRNA+H2O2組（scrambled siRNA 轉 染 +H2O2處理）、NRF2siRNA+H2O2組（NRF2siRNA轉染+H2O2處理）、HO-1siRNA+H2O2組（HO-1siRNA 轉染+H2O2處理）、scrambled siRNA+H2O2+AST 組（scrambled siRNA 轉染 +H2O2處理+AST 處理）、NRF2siRNA+H2O2+AST 組（NRF2siRNA 轉 染 +H2O2處 理 +AST 處理，H2O2+AST）及HO-1siRNA+H2O2+AST 組（HO-1siRNA轉染+H2O2處理+AST處理）。處理24 h后分別收集細胞上清液和細胞。

3.8 CCK8 法測定細胞活力 依照不同分組進行實驗處理后，每孔加入 10 μL 的 CCK8 試劑，37 ℃孵育2 h后，測定490 nm的吸光度（A）值，并計算相對細胞活力。

3.9 LDH 法測定組織/細胞損傷 依照不同分組進行實驗處理后，每孔加入10 μL 的LDH 釋放試劑，37 ℃孵育1 h，500×g離心10 min，37 ℃孵育2 h后，每孔加入10 μL 的LDH 檢測工作液，室溫避光孵育30 min，測定490 nm的吸光度（A）值，并計算LDH含量。

3.10 檢測caspase-3活性 依照不同分組進行實驗處理后，每孔加入100 μL 的裂解液，冰浴裂解10 min，4 ℃、10 000×g離心 10 min 收集上清。加入 10 μL 的檢測工作液，37 ℃孵育2 h 后，測定405 nm 的A值，并計算相對caspase-3活性。

3.11 Western blot 檢 測 H9C2 細 胞 cleaved caspase-3、NRF2 和HO-1 蛋白水平 依照不同分組進行實驗處理后，采用 RIPA 裂解 H9C2 細胞蛋白，BCA 法定量，10% SDS-PAGE 分離蛋白后轉移至 PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，I 抗（1∶2 000）孵育過夜，II 抗（1∶5 000）孵育1 h，ECL 化學發光液顯色，凝膠成像采集圖片，以β-actin作為內參照分析蛋白相對表達水平。

4 統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0 進行統計學分析和圖形繪制。計量資料用均數±標準差（Mean±SD）表示。多組之間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK（Student-Newman-Keuls）法。P＜0.05 代表差異有統計學意義。

結 果

1 黃芪甲苷對心肌缺血再灌注損傷小鼠的影響

與 sham 組相比，I/R 組小鼠 LDH 和 CK-MB 釋放顯著增多，±dp/dtmax下降（P＜0.01）；與I/R 組相比，黃芪甲苷組小鼠 LDH 和 CK-MB 釋放減少，±dp/dtmax有所上升（P＜0.01），見圖1。

2 不同濃度H2O2誘導的H9C2 細胞活力和凋亡的影響

與control 組相比，隨著處理濃度的增大，0.5、0.75 和 1 mmol/L 的 H2O2組 H9C2 細胞活力呈顯著降低趨勢，caspase-3活性呈現顯著上升趨勢（P＜0.01），見圖2。并根據細胞活力和caspase-3 活性變化趨勢，選擇0.75 mmol/L的H2O2組用于后續研究中。

3 黃芪甲苷對H2O2誘導的H9C2 心肌細胞損傷的影響

與對照組相比，不同濃度的黃芪甲苷處理H9C2細胞后LDH 釋放無顯著差異（P＞0.05）；與control 組相比，H2O2組 H9C2 細胞 LDH 釋放顯著增多、細胞活力顯著降低、caspase-3 活性和cleaved caspase-3 蛋白表達顯著增高（P＜0.01）；與H2O2組相比，H2O2+AST組H9C2 細胞LDH 釋放顯著減少、細胞活力顯著增強、caspase-3 活性和cleaved caspase-3 蛋白表達顯著降低（P＜0.01），見圖3。

4 黃芪甲苷對H2O2誘導的H9C2 心肌細胞NRF2/HO-1表達的影響

與 control 組 相 比 ，H2O2組 H9C2 細 胞 NRF2 和HO-1 蛋白表達增多（P＜0.05）；與H2O2組相比，H2O2+AST 組 H9C2 細胞 NRF2 和 HO-1 蛋白表達顯著增多（P＜0.01），見圖4。

5 NRF2/HO-1 siRNA 對黃芪甲苷拮抗H2O2誘導的H9C2心肌細胞損傷的影響

Figure 1. Effect of astragaloside IV（AST）on myocardial ischemia-reperfusion（I/R）injury mice. A：serum LDH activity；B：serum CK-MB activity；C：-dp/dtmax；D：+dp/dtmax. Mean±SD. n=20.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs I/R group.圖1 黃芪甲苷對心肌I/R損傷小鼠的影響

Figure 2. Effect of different concentrations of H2O2 on the viability and apoptosis of H9C2 cells. Mean±SD. n=8.**P＜0.01 vs control group.圖2 不同濃度H2O2誘導的H9C2細胞活力和凋亡的影響

與 scrambled siRNA 組相比，scrambled siRNA+H2O2組細胞 HO-1、NRF2 和 cleaved caspase-3 蛋白水平升高，caspase-3 活性增強，LDH 釋放增加，細胞活力下降（P＜0.05）；與scrambled siRNA+H2O2組相比，NRF2siRNA+H2O2組 和HO-1siRNA+H2O2組 細 胞HO-1 和NRF2 表達水平顯著降低，cleaved caspase-3蛋白水平和caspase-3活性顯著升高，LDH釋放增加，細胞活力降低（P＜0.05）；與scrambled siRNA+H2O2+AST 組 相 比 ，NRF2siRNA+H2O2+AST 組 和HO-1siRNA+H2O2+AST組細胞caspase-3活性增強，LDH釋放增加，細胞活力降低（P＜0.05），見圖5。

討 論

心肌缺血-再灌注損傷是心肌缺血性疾病治療過程中最常發生的病理生理學現象［14］，缺血-再灌注損傷會造成一定程度的心肌細胞受損，導致患者心功能降低，嚴重者甚至導致死亡［15］。心肌細胞再生能力相當有限，因此探索心肌缺血-再灌注損傷的發病機制，尋找新的治療策略，研發療效更好、副作用更少的藥物十分必要。

黃芪甲苷具有廣泛的生物學活性，已有研究表明，黃芪甲苷具有抑制鈣超載、抗氧化等作用［16-17］，還能抑制慢性心力衰竭大鼠心室重塑，糾正異常的能量代謝，保護心肌損傷［18］。此外，黃芪甲苷對心肌缺血再灌注損傷有一定的療效，為了進一步明確黃芪甲苷在治療心肌缺血再灌注損傷中的作用和機制，本研究通過左冠狀動脈前降支結扎復制心肌缺血再灌注損傷小鼠模型，給予黃芪甲苷干預后評估其效果。本研究結果顯示，黃芪甲苷可抑制心肌缺血再灌注損傷模型小鼠血清LDH 和CK-MB 的釋放，改善心肌血流動力學指標；而黃芪甲苷能減輕H2O2誘導的心肌H9C2 細胞模型的細胞損傷和凋亡。說明黃芪甲苷的確能減輕心肌缺血再灌注損傷。

Figure 3. The effect of astragaloside IV（AST）on the injury of H9C2 cells induced by H2O2. LDH activity（A and B），cell viability（C），caspase-3 activity（D）and cleaved caspase-3（E）were detected. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs H2O2 group.圖3 黃芪甲苷對H2O2誘導的H9C2心肌細胞損傷的影響

Figure 4. The effect of astragaloside IV（AST）on the expression of NRF2 and HO-1 in H2O2-induced H9C2 cells. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；##P＜0.01 vs H2O2 group.圖4 黃芪甲苷對H2O2誘導的H9C2心肌細胞NRF2和HO-1表達的影響

心肌缺血再灌注損傷過程中氧化應激的異常激活在心肌組織損傷中起到重要作用［19］。NRF2/HO-1信號通路是細胞抗氧化防御機制的一個組成部分，研究報道NRF2 通過上調HO-1 表達，對抗再灌注期的氧化應激水平升高，減輕細胞損傷，從而達到心肌保護的作用［20］。Yu 等［21］的研究表明二烯丙基三硫化物通過激活NRF2/HO-1介導的抗氧化劑信號通路保護心肌缺血再灌注損傷。NRF2/HO-1 信號通路可能成為心肌缺血再灌注損傷的調控靶點。本研究結果顯示，H2O2組 H9C2 細胞 NRF2/HO-1 高表達。ROS蓄積所產生的刺激使細胞NRF2 活化并上調HO-1，發揮反饋性保護作用［22］。黃芪甲苷進一步增多NRF2/HO-1 表達，說明黃芪甲苷可能是通過NRF2/HO-1 信號通路調節氧化應激來實現對心肌缺血-再灌注損傷的保護。

Figure 5. The effect of NRF2/HO-1 siRNA on H2O2-induced injury of H9C2 cells treated with AST. The results of Western blot（A，n=3），cell viability（B，n=6），LDH activity（C，n=6）and caspase-3 activity（D，n=6）were shown. Mean±SD.**P＜0.01 vs scrambled siRNA group；#P＜0.05 vs scrambled siRNA+H2O2 group；&P＜0.01，&&P＜0.05 vs scrambled siRNA+H2O2+AST group.圖5 NRF2/HO-1 siRNA對黃芪甲苷拮抗H2O2誘導的H9C2心肌細胞損傷的影響

為了進一步證實黃芪甲苷通過NRF2/HO-1信號通路發揮心肌缺血-再灌注損傷的保護，我們利用siRNA 敲減 H9C2 細胞NRF2和HO-1，結果顯示降低NRF2 和HO-1 表達后，黃芪甲苷對H2O2誘導的心肌H9C2 細胞模型損傷和凋亡的保護作用受到抑制。這表明NRF2/HO-1信號通路是黃芪甲苷保護心肌缺血再灌注損傷的調控靶點。

綜上所述，本研究證實黃芪甲苷通過上調NRF2/HO-1 信號通路抑制心肌細胞損傷和凋亡，對缺血再灌注損傷的心肌發揮保護作用。