苦參總黃酮調控Nrf2/HO-1通路對肝纖維化大鼠的機制研究*

鄭 帥， 張 凱， 高雨秋， 于 雪

（牡丹江醫學院附屬紅旗醫院藥學部，黑龍江牡丹江157000）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是多種慢性肝病引起的病理結果，如不能得到有效治療則會進展為肝硬化，甚至肝癌［1-2］。HF的特征是細胞外基質蛋白的過度積累，其作為一種可逆性疾病，可通過有效治療來減弱或逆轉［3］。但由于HF 的發病機制十分復雜，至今未研究出極其有效的治療藥物，因此其有效治療藥物的尋找仍需繼續。

苦參（Sophorae flavescens）由于具有抗炎和抗氧化的黃酮類化合物等活性成分，歷來被用于治療病毒性肝炎和癌癥等疾病［4］。有研究顯示苦參總黃酮（total flavonoids ofSophorae flavescens，TF-SF）可以有效抑制腎上腺素誘導的大鼠心肌纖維化程度［5］，但是否具有抗HF 的效果還未可知。從苦參中所提取的黃酮類化合在脂多糖刺激的RAW264.7 巨噬細胞中可通過激活Nrf2 來誘導HO-1 的表達，從而發揮免疫調節作用［6］。氧化應激參與HF 的進展，而核因子E2 相關因子（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）的抗氧化應激作用可抑制大鼠肝臟纖維化的發生［7］。TF-SF是否可能通過調控Nrf2/HO-1通路起到抗HF 的作用還未見具體闡述。由于HF 大鼠模型與人HF 具有相似的病理特征，因此，本研究通過構建HF 大鼠模型，探究TF-SF 調控Nrf2/HO-1 通路對大鼠HF 的影響，為TF-SF在HF中的作用機制研究提供參考。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物 7周齡SPF級雄性SD大鼠63只，體重（275±15）g，購自福建醫科大學［許可證號為SCXK（閩）2016-0002］，適應性飼養7 d，明暗交替12 h，進行實驗前全部大鼠禁食12 h，。本研究遵循實驗動物使用的3R 原則，經牡丹江醫學院附屬紅旗醫院實驗動物倫理委員會審批同意批準，并遵守相應章程執行。

1.2 主要試劑 TF-SF（ChemeGen）；總蛋白提取試劑盒（Ivent Blotechnologies）；BCA 蛋白檢測試劑盒（武漢純度生物科技有限公司）；兔抗Nrf2、HO-1 和GAPDH抗體及Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP）抗體（Proteintech）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑 盒 和丙 二 醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒（武漢益普生物科技有限公司）；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、透明質酸（hyaluronic acid，HA）、層粘連蛋白（laminin，LN）和Ⅲ型前膠原肽（procollagen type III peptide，PIIIP）檢測試劑盒（江西艾博因生物科技有限公司）；Ⅳ型膠原（collagen type IV，IV-C）檢測試劑盒（青島捷世康生物科技有限公司）；HE 染色試劑盒［金克隆（北京）生物技術有限公司］；Masson 染色試劑盒（Bestbio）。凝膠成像儀（ProteinSimple）；SpectraMax iD5-多功能酶標儀［美谷分子儀器（上海）有限公司］；全自動生化分析儀BS-230（南京貝登醫療股份有限公司）。

2 方法

2.1 分組與HF 大鼠模型構建 將SD 大鼠隨機分為對照（control）組（10 只）和模型（HF）組（53 只），構建 HF 模型：HF 組大鼠給予四氯化碳（CCl4）-花生油溶液（1∶1，1 mL/kg）灌胃飼養8 周（每周2 次）［8-10］，對照組大鼠灌胃等體積生理鹽水。選取3 只觀察肝臟形態，若大鼠肝臟出現質地發硬，呈暗淡紅褐色，且被膜缺乏、纖維化明顯則表明造模成功［11］。將模型組大鼠分為 HF 組、低劑量（100 mg/kg）TF-SF 組、中劑量（200 mg/kg）TF-SF 組、高劑量（400 mg/kg）TF-SF組及高劑量TF-SF+Nrf2 抑制劑全反式維甲酸（alltransretinoic acid，ATRA；7 mg/kg）組［12-13］，每組 10只。于第9 周開始低、中、高劑量TF-SF 組及高劑量TF-SF+ATRA 組大鼠分別給予相應等劑量藥物進行灌胃，而對照組和HF 組大鼠予以等量生理鹽水灌胃（每天1 次），為期4 周，實驗結束后觀察各組大鼠24 h內的一般情況。

2.2 大鼠血清學指標檢測 大鼠灌胃給藥結束后禁食24 h，4%水合氯醛麻醉，抽取腹主動脈血，4 500×g離心 15 min 取上清，ELISA 法檢測血清 SOD、MDA、GSH-Px、AST、ALT、HA、Ⅳ-C、LN和PIIIP水平。

2.3 HE及Masson染色觀察大鼠肝臟組織病理學情況 頸椎脫臼處死大鼠（5 只）取肝臟組織進行多聚甲醛固定后脫水、浸蠟包埋、制成5 μm 切片，然后脫蠟水化后分別進行HE 及Masson 染色，顯微鏡觀察染色結果。HE 染色按照《病毒性肝炎防治方案》觀察 HF 分期［14］；Masson 染色根據 Ishak 評分標準評估大鼠HF程度：0～6分，分值越大，纖維化程度越高［15］。

2.4 Western blot 檢測大鼠肝臟組織中Nrf2/HO-1通路蛋白表達水平 將剩余5 只大鼠肝臟組織放入RIPA 組織裂解液（1 mL，含1%PMSF）中裂解后冰上勻漿，20 000×g離心 15 min 取上清后使用 BCA 法進行蛋白濃度測定，將蛋白中加入上樣緩沖液進行混勻后加熱煮沸、變性5 min。配置分離膠（10%）進行SDS-PAGE 將蛋白分離后低溫下轉膜、脫脂奶粉（5%）2 h封閉，TBST緩沖液清洗后加兔抗Nrf2、HO-1和GAPDH（1∶1 000）抗體4 ℃冰箱中孵育，于次日使用TBST 清洗后加入HRP 標記的IgG II 抗（1∶10 000）進行2 h 孵育，TBST 清洗、ECL 發光試劑顯色后蛋白凝膠成像儀掃描觀察，Quantity One 4.6 分析蛋白條帶灰度，計算Nrf2和HO-1蛋白水平。

2.5 real-time PCR 檢測肝臟組織中Nrf2 和HO-1 mRNA 表達水平 使用Trizol 法提取肝組織中的總RNA，其純度及濃度經鑒定后，反轉錄為cDNA，以cDNA 為模板進行real-time PCR 擴增，引物序列見表1，反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，50 個循 環 。 采 用 2-ΔΔCt法 計 算 Nrf2 和 HO-1 mRNA 表 達水平。

表1 用于real-time PCR的引物序列Table 1. The sequences of the primers for real-time PCR

3 統計學處理

數據采用SPSS 24.0 分析，數據用均數±標準差（mean±SD）描述，單因素方差分析進行多組間比較，進一步兩兩比較行SNK-q檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

結 果

1 大鼠一般情況觀察

對照組大鼠皮毛光澤明亮、濃密，活動靈敏、食欲正常，肝臟呈鮮紅色、表明光滑、邊緣銳利；HF 組大鼠皮毛暗淡稀疏、活動遲鈍、體態瘦弱、食欲不振，肝臟質地發硬、邊緣鈍化、顏色暗淡且被膜缺乏細膩，有粗顆粒現象；與HF 組相比，低、中、高劑量TFSF組大鼠皮毛較為濃密，活動、飲食及肝臟形態均得到改善；與高劑量TF-SF 組相比，高劑量TF-SF+ATRA組大鼠活動、飲食及肝臟不良狀況加重。與對照組相比，HF 組大鼠飲食量、飲水量和體重降低，肝臟重量增加（P＜0.05）；與HF 組相比，低、中、高劑量TF-SF 組飲食量、飲水量和體重增加，肝臟重量降低（P＜0.05）；與高劑量 TF-SF 組相比，高劑量 TF-SF+ATRA 組飲食量、飲水量和體重降低，肝臟重量增加（P＜0.05），見表2。

表2 大鼠一般情況指標觀察Table 2. Observation of general indicators of rats（g. Mean±SD. n=10）

2 苦參總黃酮對大鼠抗氧化能力的影響

與對照組相比，HF 組大鼠血清SOD 和GSH-Px活性降低，MDA 含量增加（P＜0.05）；與HF 組相比，低、中、高劑量 TF-SF 組 SOD 和 GSH-Px 活性增加，MDA 含量降低（P＜0.05）；與低劑量 TF-SF 組相比，中、高劑量 TF-SF 組 SOD 和 GSH-Px 活性增加，MDA含量降低（P＜0.05）；與中劑量TF-SF 組相比，高劑量TF-SF 組 SOD 和 GSH-Px 活性增加，MDA 含量降低（P＜0.05）；與高劑量 TF-SF 組相比，高劑量 TF-SF+ATRA 組 SOD 和 GSH-Px 活性降低，MDA 含量增加（P＜0.05），見表3。

表3 苦參總黃酮對大鼠抗氧化能力的影響Table 3. Effect of total flavonoids of Sophora flavescens（TF-SF）on antioxidant capacity of rats（Mean±SD. n=10）

3 苦參總黃酮對大鼠肝功能及纖維化指標的影響

與對照組相比，HF 組大鼠血清AST、ALT、HA、Ⅳ-C、LN 和PIIIP 水平升高（P＜0.05）；與HF 組相比，低、中、高劑量 TF-SF 組AST、ALT、HA、Ⅳ-C、LN 和PIIIP 水平降低（P＜0.05）；與低劑量 TF-SF 組相比，中、高劑量TF-SF 組AST、ALT、HA、Ⅳ-C、LN 和PIIIP水平降低（P＜0.05）；與中劑量TF-SF 組相比，高劑量TF-SF 組 AST、ALT、HA、Ⅳ-C、LN 和 PIIIP 水平降低（P＜0.05）；與高劑量 TF-SF 組相比，高劑量 TF-SF+ATRA 組 AST、ALT、HA、Ⅳ-C、LN 和 PIIIP 水平升高（P＜0.05），見表4。

4 苦參總黃酮對大鼠肝組織病理學的影響

對照組大鼠肝臟組織中肝小葉形態結構清晰完整、肝索結構完整、肝細胞呈放射狀排列有序，未出現纖維組織增生及炎癥細胞浸潤現象；HF 組大鼠肝臟組織中肝小葉及肝索結構嚴重破壞，有明顯炎癥細胞浸潤、纖維組織增生、大量膠原沉積、細胞壞死現象發生；與HF 組相比，低、中、高劑量TF-SF 組肝組織組織細胞壞死、炎癥浸潤、膠原沉積及纖維化程度得到改善；與高劑量TF-SF 組相比，高劑量TF-SF+ATRA 組肝組織病理程度加重，見圖1、2。與對照組相比，HF 組大鼠HF 分期和半定量評分升高（P＜0.05）；與 HF 組相比，低、中、高劑量 TF-SF 組 HF 分期和半定量評分降低（P＜0.05）；與低劑量TF-SF 組相比，中、高劑量TF-SF 組HF 分期和半定量評分降低（P＜0.05）；與中劑量TF-SF 組相比，高劑量TF-SF組HF 分期和半定量評分降低（P＜0.05）；與高劑量TF-SF 組相比，高劑量 TF-SF+ATRA 組 HF 分期和半定量評分升高（P＜0.05），見表5。

5 苦參總黃酮對大鼠肝組織Nrf2/HO-1 通路相關蛋白的影響

與對照組相比，HF 組大鼠肝組織Nrf2 和HO-1水平降低（P＜0.05）；與HF 組相比，低、中、高劑量TF-SF 組Nrf2 和HO-1 水平升高（P＜0.05）；與低劑量TF-SF 組相比，中、高劑量 TF-SF 組 Nrf2 和 HO-1 水平升高（P＜0.05）；與中劑量TF-SF 組相比，高劑量TFSF 組Nrf2 和HO-1 水平升高（P＜0.05）；與高劑量TFSF 組相比，高劑量 TF-SF+ATRA 組 Nrf2 和 HO-1 水平降低（P＜0.05），見圖3。

表4 苦參總黃酮對大鼠肝功能及纖維化指標的影響Table 4. Effects of total flavonoids of Sophora flavescens（TF-SF）on liver function and fibrosis indexes in rats（Mean±SD. n=10）

Figure 1. The effect of total flavonoids of Sophora flavescens（TF-SF）on liver histopathology of rats（HE staining）. A：control group；B：HF group；C：low-dose TF-SF group；D：middle-dose TF-SF group；E：high-dose TF-SF group；F：high-dose TF-SF+ATRA group. The scale bar=50 μm. The red arrow points to inflammatory cells，the black arrow points to cavitation.圖1 苦參總黃酮對大鼠肝組織病理學的影響

Figure 2. The effect of total flavonoids of Sophora flavescens（TF-SF）on liver fibrosis in rats（Masson staning）. A：control group；B：HF group；C：low-dose TF-SF group；D：middle-dose TF-SF group；E：high-dose TF-SF group；F：high-dose TF-SF+ATRA group. The scale bar=50 μm. The arrow points to collagen deposition.圖2 苦參總黃酮對大鼠肝纖維化的影響

表5 苦參總黃酮對HF分期及半定量評分的影響Table 5. Effects of total flavonoids of Sophora flavescens（TF-SF）on HF staging and semi-quantitative score（Mean±SD. n=10）

Figure 3 Effects of total flavonoids of Sophora flavescens（TF-SF）on Nrf2/HO-1 pathway-related proteins in rat liver. A：control group；B：HF group；C：low-dose TF-SF group；D：middle-dose TF-SF group；E：high-dose TF-SF group；F：high-dose TF-SF+ATRA group. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs A；#P＜0.05 vs B；&P＜ 0.05 vs C；△P＜0.05 vs D；▲P＜0.05 vs E.圖3 苦參總黃酮對大鼠肝組織Nrf2/HO-1通路相關蛋白的影響

6 苦參總黃酮對大鼠肝組織Nrf2 和HO-1 mRNA表達的影響

與對照組相比，HF 組大鼠肝組織Nrf2 和HO-1 mRNA 表達水平降低（P＜0.05）；與HF 組相比，低、中、高劑量 TF-SF 組 Nrf2 和 HO-1 mRNA 表達水平升高（P＜0.05）；與低劑量TF-SF 組相比，中、高劑量TFSF 組 Nrf2 和 HO-1 mRNA 表達水平升高（P＜0.05）；與中劑量TF-SF 組相比，高劑量TF-SF 組Nrf2 和HO-1 mRNA 表達水平升高（P＜0.05）；與高劑量TF-SF 組相比，高劑量 TF-SF+ATRA 組 Nrf2 和 HO-1 mRNA 表達水平降低（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. Effects of total flavonoids of Sophora flavescens（TF-SF）on Nrf2 and HO-1 mRNA in liver tissues of rats. A：control group；B：HF group；C：low-dose TF-SF group；D：middle-dose TF-SF group；E：high-dose TF-SF group；F：high-dose TF-SF+ATRA group. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs A；#P＜0.05 vs B；&P＜0.05 vs C；△P＜0.05 vs D；▲P＜0.05 vs E.圖4 苦參總黃酮對大鼠肝組織Nrf2和HO-1 mRNA表達的影響

討 論

HF 是肝損傷和修復的結果，其作為各種慢性肝病的常見病理特征，若不受控制最終會發展為肝硬化，造成不可逆的肝損傷［16］。HF 的主要參與者肝星狀細胞活化后可通過產生α-平滑肌肌動蛋白和I 型膠原α1 來促進細胞外基質中的膠原沉積，由此造成HF 的發生［17］。目前 HF 仍缺乏有效治療藥物，因此需要尋找新的有效治療藥物來改善HF。

苦參作為一種中草藥具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤和抗纖維化的功效，其主要活性成分有生物堿、黃酮類化合物，有研究已表明，其有效活性成分苦參堿已被用于治療慢性肝病［18］。苦參堿可通過抑制HSC表面表皮生長因子受體活化來減輕HF［19］。苦參素可有效降低慢性乙型肝炎患者血清HF 指標，改善肝功能，抑制 HF 進程［20］，但至今苦參總黃酮的抗 HF 作用還未見闡明。氧化應激已被證明參與了HF 的發生，大量產生的活性氧會促進肝星狀細胞的增殖和遷移，進而促HF［6］。研究顯示，苦參總黃酮可通過降低氧化應激及膠原合成來抑制大鼠心肌纖維化程度［5］。本研究結果顯示，苦參總黃酮增加HF 大鼠SOD 和 GSH-Px 水平，降低 MDA 含量，該結果表明，苦參總黃酮能夠有效抑制HF 大鼠氧化應激損傷，增加抗氧化能力，從而可能起到改善HF 的作用，與前人研究結果相似［5-6］。研究顯示，當HF發生時大鼠血清中 AST、ALT、HA、IV-C、LN 和 PIIIP 水平顯著增加［21］。本研究結果顯示，苦參總黃酮可劑量依賴性的降低HF 大鼠血清HF 及肝功能指標水平、HF 分期及半定量評分，該結果表明，苦參總黃酮能夠有效抑制大鼠HF 程度及膠原沉積，改善肝損傷，提示苦參總黃酮具有治療HF的潛在作用。

Nrf2 作為能夠誘導抗氧化應激基因轉錄的重要轉錄因子，可通過促進抗氧化酶HO-1 的表達來起到抗氧化應激的效果［6］。激活 Nrf2 可以減緩 HF 的發展，有研究顯示，醛脫氫酶2 可通過激活Nrf2/HO-1抗氧化途徑來減輕CCl4誘導的小鼠HF［22］。骨髓來源的間充質干細胞通過激活Nrf2/HO-1 信號來抑制大鼠氧化應激、炎癥和HF［23］。丹參素通過激活Nrf2/HO-1 信號通路，增加HF 大鼠血清中SOD 和GSH-Px水平，降低MDA 含量，從而抑制氧化應激［24］。苦參黃酮類化合物苦參素可通過激活Kelch 樣ECH 相關蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，KEAP1）/Nrf2 通路來誘導HO-1 的表達，以此在脂多糖刺激的巨噬細胞發揮免疫抑制作用［7］。本研究結果顯示，苦參總黃酮劑量依賴性的可顯著激活Nrf2/HO-1 通路，除此之外，Nrf2 抑制劑可逆轉苦參總黃酮對大鼠HF 的改善，該結果表明，苦參總黃酮對HF 大鼠氧化應激及HF 的改善作用可能與其激活Nrf2/HO-1通路有關。

綜上所述，苦參總黃酮可能通過激活Nrf2/HO-1通路來抑制氧化應激，從而起到抗大鼠HF 的作用。本研究通過探究苦參總黃酮在HF 大鼠中可能的作用機制，不僅為苦參總黃酮在HF 中的治療機制研究提供依據，還對HF 新型治療藥物的尋找具有一定的參考價值，但在接下來的研究中，還需對苦參總黃酮在HF中的其他作用機制進行深入探究。