基于馬賽克HA序列的H9亞型禽流感滅活疫苗的免疫效力分析

李 麗，唐國毅，馮賀龍，薛玉涵，任 助，王國康，賈妙妙，商 雨,2,3，羅青平,2,3，邵華斌,2,3，溫國元,2,3*

(1.湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所，武漢 430064；2.農業部畜禽細菌病防治制劑創制重點實驗室，武漢 430064；3.畜禽病原微生物學湖北省重點實驗室，武漢 430064)

H9亞型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)在自然界中廣泛存在與傳播，給養禽業造成嚴重經濟損失的同時，也嚴重影響到了公共衛生安全。H9亞型 AIV屬于低致病性禽流感病毒(low-pathogenic AIV,LPAIV)，家禽對其高度易感，能夠造成呼吸道疾病、產蛋量急劇下降等，但死亡率不高，與其他病原體混合感染后，發病及死亡率會顯著提升[1-5]。

目前在全世界流行的H9亞型AIV主要分為北美和歐亞兩大譜系，歐亞譜系進一步發展形成不同的病毒群，如A/chicken/Beijing/1/1994(BJ/94-like)，A/duck/Hong Kong/Y280/1997(Y280-like)，A/quail/Hong Kong/G1/1997(G1-like)，A/duck/Hong Kong/Y439/1997(Y439-like)和A/chicken/Shanghai/F/1998(F/98-like)等[6-8]。與中亞和中東地區的H9亞型AIV相比，中國分離株在HA和NA基因的進化樹中屬于獨立分支[8]。在我國，G1-like主要在南方地區的鵪鶉中流行，BJ/94-like和F/98-like分別在北方和東部地區雞群中流行[8-9]。國內對H9亞型AIV的防控以免疫預防為主，目前市場上的H9禽流感疫苗以滅活疫苗為主[10]，盡管有很多H9亞型禽流感滅活疫苗在應用，但H9亞型禽流感疫情仍然沒有得到有效控制。近年來，H9N2亞型AIV在免疫雞群中有較高的分離率，病毒在免疫壓力、自身變異等多因素作用下發生了抗原漂移，導致現有疫苗的免疫保護效力降低[11-14]。H9亞型AIV的基因重組、變異不僅給當前禽流感的防控工作帶來了困難，也對人類健康構成了潛在的威脅[15-16]，迫切需要研發一種具有廣泛交叉保護作用的H9亞型禽流感疫苗。

馬賽克(mosaic)疫苗主要是針對抗原表位多變的病毒免疫原性蛋白，設計抗原表位覆蓋率高的免疫原性蛋白基因序列，以實現對高度變異的病毒產生通用免疫保護作用[17]。該技術利用遺傳算法將所有目的蛋白序列中潛在的抗原表位整合至一條新的目的蛋白序列，使其可提供比其他野生型蛋白更為廣泛的流行變異株免疫保護。本研究設計并合成了H9亞型 AIVHA基因的mosaic序列，采用反向遺傳操作技術，以mosaicHA序列替換H1N1亞型流感病毒PR8株的HA片段，獲得了重組禽流感病毒rPR8-HAm/H9株，并在SPF雛雞上評價了其作為滅活疫苗的免疫保護效果，為后續H9亞型禽流感通用疫苗的開發提供了新的思路和方法，可為廣譜禽流感疫苗的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌(毒)株、載體、細胞及實驗動物

H9N2亞型禽流感毒株A/chicken/JM0305/2017(簡稱JM0305)為本實驗室分離鑒定保存；DH5α感受態細胞購自TaKaRa公司；表達質粒PHW2000及包含有H1N1亞型流感病毒PR8株7個 基因的重組質粒PHW2000-PB2、PHW2000-PB1、PHW2000-PA、PHW2000-NP、PHW2000-NA、PHW2000-M和PHW2000-NS均由本實驗室構建保存；犬腎細胞(MDCK)和人源胚胎腎細胞(HEK-293T)由本實驗室保存；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司；SPF雞由本實驗室孵化，隔離器飼養。

1.2 主要試劑

2×Phata Max Master Mix，2 ×Rapid Taq Master Mix，ClonExpress Ⅱ DNA連接酶，HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix均購自諾唯贊公司；SmaⅠ、BamH Ⅰ、ScaⅠ、DpnⅠ等限制性內切酶均購自TaKaRa公司；LipofectamineTM3000轉染試劑、DMEM培養基、胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司；膠回收試劑盒、質粒提取盒均購自OMEGA公司；動物免疫佐劑MERCKINADE SDA25購自美國默凱納-萬諾公司。

1.3 Mosaic HA序列(HAm/H9)的設計與合成

從NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載了總計3 957條H9 亞型AIV的HA氨基酸序列，剔除不完整和多余的序列，最終將2 219條序列上傳至馬賽克疫苗設計網站(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/MOSAIC/makeVaccine.html)，設計Mosaic HA序列[18]，參數選項中Cocktail Size設置為“1”，以產生一個單一的肽，即為HAm/H9。閾值設置為“3”，表位長度參數被設置為12-mer，與天然T細胞表位的長度匹配[19]。利用BepiPred 1.0 Serve和NetTepi 1.0 Serve分別預測HAm/H9序列及H9亞型AIV各分支代表株HA序列的B細胞表位和T細胞表位。將HAm/H9基因由生工生物公司進行密碼子優化并合成。

1.4 重組質粒的構建與病毒拯救

將HAm/H9序列插入至PHW2000表達質粒，參照HAm/H9和PHW2000的序列，采用Primer 5.0軟件設計特異性引物，通過引物延伸PCR方法，在插入片段HAm/H9的兩端分別引入其與PHW2000質粒連接處的同源臂(長度為15 bp)，利用In-fusion克隆連接技術，構建并獲得重構質粒PHW2000-HAm/H9。

利用LipofectamineTM3000將質粒PHW2000-PB2、PHW2000-PB1、PHW2000-PA、PHW2000-HAm/H9、PHW2000-NP、PHW2000-NA、PHW2000-M、PHW2000-NS共轉染至混合培養有MDCK和HEK-293T細胞的6孔板中，48 h后收取細胞培養基上清，反復凍融后接種9日齡SPF雞胚，收取HA陽性的樣品進行RT-PCR擴增與測序分析，將鑒定正確的重組病毒命名為rPR8-HAm/H9。

1.5 重組病毒生長曲線測定

將重組病毒以0.1 MOI接種于MDCK細胞，于12、24、36、48、60、72 h收取細胞上清測定病毒滴度，記錄細胞病變情況，按照Reed-Muench公式計算病毒的TCID50，繪制病毒的生長曲線。

1.6 重組病毒的免疫原性測定

1.6.1 滅活疫苗的制備與免疫 將重組病毒rPR8-HAm/H9株及JM0305株病毒尿囊液稀釋至108EID50·0.1 mL-1，以終濃度為0.1%的甲醛滅活。滅活完全的病毒液以3∶1質量比加入動物免疫佐劑，低速攪拌至滅活疫苗完全乳化。

選取1周齡SPF雛雞，分為A、B、C、D、E、F組，每組12羽。A組和B組通過肌內注射的方式免疫JM0305株，注射劑量0.1 mL·只-1；C組和D組以相同方式和劑量的免疫rPR8-HAm/H9株。E組和F組為PBS對照組。首免兩周后，每組隨機采集血清5份，同時對所有試驗組進行加強免疫，接種途徑和劑量不變。加強免疫后14 d，每組隨機采集血清5份。

1.6.2 血凝抑制(HI)抗體測定 分別以rPR8-HAm/H9株及JM0305株配制四單位抗原，測定采集血清的HI抗體水平。

1.6.3 中和抗體測定 將血清進行連續2倍梯度稀釋，與等體積病毒液(100 TCID50·0.1 mL-1)混合，置于適當的條件下感作一段時間后，取混合液0.2 mL接種生長在96孔板的MDCK細胞，觀察記錄接種細胞的病變情況，計算出能夠使50%的細胞培養孔不發生病變的血清最高稀釋度，即為該血清的中和效價。

1.6.4 攻毒保護效果 加強免疫后14 d，采取滴鼻點眼方式，分別用rPR8-HAm/H9株(A、C、E組)及JM0305株(B、D、F組)進行攻毒試驗，攻毒劑量為106EID50·只-1。攻毒后，觀察SPF雞健康狀況，如出現精神沉郁、嗜睡，采食量、飲水量減少、腹瀉等狀況，則判定其感染發病。分別于攻毒后第3、5、7天從各組隨機采集10只雛雞的喉頭、泄殖腔拭子，作除菌處理后以100 μL·枚-1接種9日齡SPF雞胚3枚，置37 ℃培養72 h，收取尿囊液，測定HA效價，以3枚之一出現HA≥24作為攻毒不保護的判定標準，對病毒感染為陰性的雞胚尿囊液應該盲傳一代，再次確認HA效價。

2 結 果

2.1 HAm/H9序列抗原表位預測分析

從NCBI數據庫中下載得到2 219條完整的H9亞型AIVHA基因序列，以其作為背景蛋白集，通過在線設計的方式，優化設計并合成了一條H9亞型AIV的mosaicHA基因序列HAm/H9。利用在線軟件BepiPred 1.0 Serve及NetTepi 1.0 Serve，預測了HAm/H9蛋白序列的B細胞表位和T細胞表位，將其在HAm/H9蛋白序列中進行了標注(圖1)。同時，對H9亞型AIV的各進化分支代表毒株的HA基因抗原表位也進行了預測。結果如表1所示，相較于其他代表毒株，HAm/H9涵蓋了最多的潛在抗原表位，其中B細胞表位有36個，T細胞表位有45個。

圖1 HAm/H9蛋白的抗原表位分析結果Fig.1 The map of HAm/H9 protein epitopes

表1 H9亞型禽流感病毒的HA及HAm/H9序列的抗原表位比較Table 1 Prediction of epitopes about HAm/H9 and HA genes of representative strains

2.2 重組質粒的構建與病毒拯救

通過PCR擴增獲得插入片段HAm/H9和載體片段PHW2000，以1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶，目的條帶大小與預期相符，分別為1 700和3 090 bp(圖2)。通過In-fusion克隆方式，將插入片段與載體片段連接，并轉化感受態細胞，挑取陽性克隆，提取質粒，測序結果正確，重組表達質粒PHW2000-HAm/H9構建成功。

M.DL5000 DNA相對分子質量標準;1.PHW2000;2.HAm/H9M.DL5000 DNA marker;1.PHW2000;2.HAm/H9圖2 線性化載體PHW2000和插入片段HAm/H9的擴增Fig.2 Amplification of PHW2000 and HAm/H9

采用“7+1”反向遺傳操作系統，將PHW2000-HAm/H9重組質粒與PR8株的7個基因(除HA外)表達質粒共轉染至HEK-293T和MDCK混養細胞，待細胞產生病變，收取細胞反復凍融，接種9日齡 SPF雞胚，RT-PCR方法檢測HA陽性尿囊液中重組病毒的HAm/H9基因，目的條帶大小約為1 800 bp(圖3)，與預期一致，測序結果正確，表明重組病毒拯救成功，命名為rPR8-HAm/H9。

M.DL2000 DNA相對分子質量標準;1～3.不同HA陽性尿囊液PCR擴增結果;4.陰性對照M.DL2000 DNA marker;1-3.PCR amplification of HA positive allantoic fluid;4.Negative control圖3 RT-PCR鑒定重組病毒rPR8-HAm/H9Fig.3 Identification of recombinant virus rPR8-HAm/H9 by RT-PCR

2.3 重組病毒的生長曲線

將重組病毒rPR8-HAm/H9株及PR8親本株分別以0.1 MOI接種于含有MDCK單層細胞的96孔 板，分別于12、24、36、48、60、72 h取上清測定病毒滴度，繪制兩株病毒的生長曲線。結果顯示，重組病毒rPR8-HAm/H9株和PR8親本株在感染MDCK細胞后60～72 h達到平臺期，滴度分別是106.0、105.4TCID50· mL-1(圖4)，重組病毒的細胞增殖滴度略高于PR8親本株。

圖4 rPR8-HAm/H9及PR8株在MDCK細胞的生長曲線Fig.4 Growth kinetics of rPR8-HAm/H9 and PR8 in MDCK cell

2.4 重組病毒的免疫原性

評估了重組病毒作為H9亞型禽流感滅活疫苗在SPF雞上的免疫原性，分別在首免(primary immune)和二免(secondary immune)兩周后采集血清，用兩種病毒的四單位抗原以HI法測定血清的抗體水平，同時檢測免疫血清的中和抗體水平，并在二免后2周分別用rPR8-HAm/H9和JM0305進行攻毒試驗，統計攻毒后的發病情況和排毒情況，綜合分析重組病毒滅活疫苗的免疫原性。

2.4.1 HI抗體 分別以兩種病毒(rPR8-HAm/H9株和JM0305株)配制四單位抗原，以HI法測定各試驗組雞血清的AIV HI抗體水平，結果如圖5所示，rPR8-HAm/H9滅活疫苗加強免疫2周后，以兩種抗原測定的HI結果分別為25.6(rPR8-HAm/H9)和24(JM0305)。JM0305滅活疫苗加強免疫2周后血清抗體水平分別為26(JM0305)和23(rPR8-HAm/H9)。與首次免疫的抗體水平相比，JM0305免疫組針對rPR8-HAm/H9的抗體結果沒有顯著變化。結果表明rPR8-HAm/H9免疫組的血清與JM0305株具有較好的交叉反應。

2.4.2 中和抗體 采取固定病毒稀釋血清的方法測定各試驗組血清的中和抗體效價，結果如表2所示，rPR8-HAm/H9滅活疫苗免疫組的血清對自身中和抗體效價達到1∶22，對JM0305株的中和抗體效價為1∶10。JM0305株的血清對自身中和抗體效價為1∶16，對rPR8-HAm/H9株的血清中和抗體效價為1∶2。結果表明rPR8-HAm/H9免疫組可產生針對JM0305株的中和抗體。

A.首免；B.二免A.Primary immune;B.Secondary immune圖5 rPR8-HAm/H9及JM0305滅活疫苗免疫后抗體水平Fig.5 HI antibody after immunization of rPR8-HAm/H9 and JM0305 inactivated vaccine

表2 滅活疫苗免疫雞的中和抗體效價Table 2 Titer of neutralizing antibody in inactivated vaccine immunized chicken

2.4.3 攻毒保護效果 H9N2 AIV屬于低致病性禽流感病毒，感染后不會引起試驗雞死亡，rPR8-HAm/H9免疫組用rPR8-HAm/H9株攻毒，所有SPF雛雞均未出現發病癥狀；用JM0305株攻毒，75%SPF雛雞未發病。JM0305免疫組分別使用JM0305和rPR8-HAm/H9攻毒時，SPF雛雞的發病率分別為10%和70%。排毒結果如表3所示，rPR8-HAm/H9免疫組用rPR8-HAm/H9及JM0305攻毒后僅在第3天的喉頭和泄殖腔有少量排毒，保護率分別為70%和80%。JM0305免疫組對rPR8-HAm/H9和JM0305的攻毒保護率分別為10%和50%。PBS對照組對rPR8-HAm/H9和JM0305的攻毒無保護作用，均可分離到病毒。綜上，無論是以同源還是異源病毒攻擊，rPR8-HAm/H9免疫后均可顯著降低雛雞的發病率和攻毒排毒率，提供了較好的交叉保護作用。

表3 攻毒后排毒檢測結果Table 3 The results of virus shedding post-challenge

3 討 論

H9N2亞型禽流感病毒屬于低致病性禽流感病毒，可持續在野禽和家禽種群內和群間傳播，具有高度的遺傳多樣性，雖然此類病毒在家禽中的發病率和死亡率通常較低，但是會引起禽類產蛋下降、混合感染和繼發感染，造成嚴重的經濟損失[20]。另外有研究表明，LPAIV通過基因重組增加了高致病性禽流感病毒的遺傳多樣性，甚至可能由于HA蛋白裂解位點堿性氨基酸的插入或者替換造成毒株致病力的增強[21-22]，因此降低H9N2 AIV的傳播對于禽流感防控具有重要意義。研究表明使用與當地的流行株匹配性不佳的疫苗株也可能會促進AIV的變異進化[23-25]。因此，為了更好地防控H9亞型禽流感，亟需研發具有較好交叉保護效果的高效、通用疫苗。

近些年，一種新的mosaic疫苗制備技術首先被應用到人類免疫缺陷病毒(HIV)疫苗學領域，與自然分離株的基因序列相比，人工設計合成的mosaic HIV-1 Gag、Pol和Env序列擴大了細胞免疫的廣度和深度，提供了更廣泛交叉保護[17，26]。其原因在于該技術分析選擇并整合所有的潛在抗原表位于一條完整基因序列中，以9～12個氨基酸為一個完整的抗原表位多肽，最大程度地覆蓋了病毒群體的抗原表位。據推測，這種拼接方法可以保留更多的結構保守序列，使得mosaic序列具有更多的構象表位[18，27]。該技術同樣適用于高度變異的禽流感病毒，已有研究證實mosaic H5 HA在小鼠和猴子體內具有較好的免疫原性，可以預防H5N1亞型AIV多個分支毒株的感染[28-30]。

本研究優化設計了1條mosaic H9HA序列，以其替換PR8株的HA基因，拯救獲得1株重組H9N1禽流感病毒rPR8-HAm/H9株。將以重組病毒制備的滅活疫苗免疫SPF雛雞，加強免疫后進行攻毒試驗，檢測了免疫后的血清HI抗體、中和抗體及攻毒保護效果。結果表明，與自然分離的JM0305株滅活疫苗相比，rPR8-HAm/H9株滅活疫苗在交叉保護上顯示出較大的優勢，它既可以對同源病毒rPR8-HAm/H9產生免疫保護，又可以對異源JM0305株產生保護，可顯著抑制攻毒后的排毒，保護率分別為70%和80%，具有較好的交叉保護效果。而JM0305株滅活疫苗免疫后雖然可以產生針對rPR8-HAm/H9株的HI抗體，但交叉保護效果差。

4 結 論

本研究制備了一種基于mosaic HA序列的H9亞型禽流感滅活疫苗，可對異源H9N2亞型AIV JM0305株提供較好的攻毒保護，表明其可作為潛在的H9亞型通用疫苗候選株，后續將通過毒株優化和佐劑篩選，進一步增強其免疫原性，應用更多的異源毒株測定其通用保護效果，為廣譜禽流感疫苗研發提供思路和參考。